[發明專利]一種利用離子液體和蛋白酶提取柞蠶絲絲素蛋白的方法

在審

• 申請號: 201710626825.8
• 申請日: 2017-07-28
• 公開（公告）號: CN107266548A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發明（設計）人: 胡智文;陳茹茹;李津;梁軍龍;徐城鋒
• 申請（專利權）人: 浙江理工大學
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C12P21/06;C07K1/02;C07K1/14;C07K1/34
• 代理公司: 嘉興永航專利代理事務所(普通合伙)33265
• 代理人: 江程鵬

技術領域

本發明涉及絲素蛋白提取領域，尤其涉及一種利用離子液體和蛋白酶提取柞蠶絲絲素蛋白的方法。

背景技術

蠶絲主要由絲素蛋白和絲膠蛋白組成，其中絲素蛋白約占70%，是蠶絲的主要成分。絲膠為球狀蛋白，組成氨基酸中含有大量極性親水側基，穩定性差，可溶于酸、堿、蛋白酶以及低濃度碳酸鈉等溶液中；而絲素為纖維狀蛋白，天然絲素纖維含有大量分子內和分子間氫鍵, 結晶度較高而難溶解于一般溶劑。

生活中比較常見的是桑蠶絲和柞蠶絲，主要由甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、絲氨酸（Ser）和酪氨酸（Tyr）組成，但氨基酸含量和分布差異較大。在柞蠶絲素中，具有活潑基團的氨基酸（如精氨酸、天冬氨酸等）比桑蠶絲多，色氨酸、組氨酸的含量是桑蠶絲的5倍，柞蠶絲的丙氨酸含量為40%，桑蠶絲為30%。故柞蠶絲中肽鏈的彎曲和纏結程度比桑蠶絲大，這就使柞蠶絲的剛度、耐溶劑能力高于桑蠶絲。

目前，在研究過程中，常采用強酸、強堿、高濃度的鹽溶液如高濃度CaCl₂溶液、銅氨溶液、溴化鋰溶液、硫氰化鋰溶液等對桑蠶絲絲素蛋白進行溶解,但這些溶劑存在對蛋白質分子降解嚴重、有毒害、不穩定、不易回收等缺點，同時對柞蠶絲絲素蛋白的提取效果較差。

離子液體(IL)是近年來興起的一類極具應用前景的綠色溶劑,廣泛應用于電化學 、有機合成 、化工分離 、材料制備等領域。所謂的離子液體就是在室溫（或者稍高于室溫的溫度）下呈液態的離子體系，與常見的有機溶劑不同，離子液體中存在強大的靜電相互作用，因此表現出非同尋常特點：非揮發性、高穩定性、良好的導電與導熱性、選擇性溶解力與可設計性，同時具有環保無害、可循環使用的特性。

發明內容

為了解決上述技術問題，本發明提供了一種利用離子液體和蛋白酶提取柞蠶絲絲素蛋白的方法。本發明的提取方法較為溫和，對絲素蛋白損傷小，使用原料環保，無毒害，且提取效率較高。

本發明的具體技術方案為：一種利用離子液體和蛋白酶提取柞蠶絲絲素蛋白的方法，以g和mL計，包括以下步驟：

1）稱取3.5-4.5g柞蠶絲，用去離子水清洗，去除表面污染物，烘干。

2）將烘干的柞蠶絲以1:95-105的浴比在含有0.4-0.6wt%的Na₂PO₄和0.8-1.2wt%的C₁₇H₃₅COONa的混合溶液中煮沸25-35min，進行脫膠處理，共脫膠四次。

脫膠過程中，隨著絲膠的水解，溶液中氨基酸的濃度逐漸增加，pH降低，脫膠效率減弱，所以需加堿以維持脫膠液pH值的穩定，但堿濃度過大會損傷絲素，所以采用C₁₇H₃₅COONa作為緩沖劑。

3）脫膠之后，將柞蠶絲用去離子水搓洗4次以上，放入55-65℃烘箱，得到干燥的絲素纖維。

4）稱取1.8-2.2g干燥的絲素纖維，以1:45-55的浴比浸入[AMIM]Cl離子液體中，控制反應溫度在80~100℃范圍內，在油浴中攪拌5-7h，反應完成后，冷卻至室溫。

5）向步驟4）中離子液體內加入PM₁₃-堿性蛋白酶粉末0.25-0.35g，在40~55℃的油浴中攪拌5-7h，得到絲素/離子液體溶液后，進行滅酶。

生物酶是一種無毒無害、與環境友好的催化劑，擁有高效的特異性；且用量少，水解條件（溫度、pH）溫和，減少污染，節約資源。離子液體(IL)是近年來興起的一類極具應用前景的綠色溶劑，對絲素蛋白表現出一定的溶解性。

本發明采用PM₁₃對堿性蛋白酶進行修飾，以保持堿性蛋白酶在離子液體中的穩定性和活性。堿性蛋白酶本身也是一種蛋白質，離子液體對其結構具有一定的破壞作用，PM₁₃處是一種梳狀共聚物，可以覆蓋在堿性蛋白酶表面，防止堿性蛋白酶被離子溶液破壞，同時借助PM13鏈對IL的親和性，不但可以提高酶的穩定性，保證酶在離子液體中的活性，而且使酶均勻的分散在IL中。