[發(fā)明專利]一種利用離子液體和蛋白酶提取柞蠶絲絲素蛋白的方法

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• 申請日: 2017-07-28
• 公開（公告）號: CN107266548A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發(fā)明（設計）人: 胡智文;陳茹茹;李津;梁軍龍;徐城鋒
• 申請（專利權）人: 浙江理工大學
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C12P21/06;C07K1/02;C07K1/14;C07K1/34
• 代理公司: 嘉興永航專利代理事務所(普通合伙)33265
• 代理人: 江程鵬

1.一種利用離子液體和蛋白酶提取柞蠶絲絲素蛋白的方法，其特征在于，以g和mL計，包括以下步驟：

1）稱取3.5-4.5g柞蠶絲，用去離子水清洗，去除表面污染物，烘干；

2）將烘干的柞蠶絲以1:95-105的浴比在含有0.4-0.6wt%的Na₂PO₄和0.8-1.2wt%的C₁₇H₃₅COONa的混合溶液中煮沸25-35min，進行脫膠處理，共脫膠四次；

3）脫膠之后，將柞蠶絲用去離子水搓洗4次以上，放入55-65℃烘箱，得到干燥的絲素纖維；

4）稱取1.8-2.2g干燥的絲素纖維，以1:45-55的浴比浸入[AMIM]Cl離子液體中，控制反應溫度在80~100℃范圍內，在油浴中攪拌5-7h，反應完成后，冷卻至室溫；

5）向步驟4）中離子液體內加入PM₁₃-堿性蛋白酶粉末0.25-0.35g，在40~55℃的油浴中攪拌5-7h，得到絲素/離子液體溶液后，進行滅酶；

6）待絲素/離子液體溶液冷卻至室溫，加入無水乙醇，反復浸泡，使絲素蛋白析出，對混合物進行真空抽濾，向濾出的絲素蛋白中加入去離子水，反復浸泡后過濾，再將溶液裝入透析袋中透析20-28h，得到純凈的絲素蛋白溶液；

7）對得到的絲素蛋白溶液進行冷凍干燥，即可得到絲素蛋白粉末。

2.如權利要求1所述的一種利用離子液體和蛋白酶提取柞蠶絲絲素蛋白的方法，其特征在于，步驟4）中，所述[AMIM]Cl離子液體的制備方法為：按1.0-1.5:1的摩爾比向反應容器中加入烯丙基氯和N-甲基咪唑，在55-65℃油浴中攪拌回流6~8h，反應完畢后，采用旋轉蒸發(fā)除去過量的2-甲基烯丙基氯，得到淺黃色透明液體，即[AMIM]Cl離子液體，冷凍干燥20-28h后，解凍待用。

3.如權利要求1所述的一種利用離子液體和蛋白酶提取柞蠶絲絲素蛋白的方法，其特征在于，步驟5）中，所述PM₁₃-堿性蛋白酶的制備方法為：向90-110mL的0.1M的硼酸鈉緩沖溶液中加入0.10-0.20g堿性蛋白酶和3.5-4.0g PM₁₃，在1-5℃條件下緩慢攪拌0.5-1.5h，在外加45-55mL 1mmol/L HCl的條件下超濾除去未反應的PM₁₃，重復三次，將濾液進行冷凍干燥，得到PM₁₃-堿性蛋白酶粉末，待用。

4.如權利要求3所述的一種利用離子液體和蛋白酶提取柞蠶絲絲素蛋白的方法，其特征在于，所述PM₁₃為MW15000梳狀PEG。

5.如權利要求4所述的一種利用離子液體和蛋白酶提取柞蠶絲絲素蛋白的方法，其特征在于，在PM₁₃-堿性蛋白酶的制備過程中，冷凍干燥前，預先在-20℃條件下冷凍4h。

6.如權利要求1所述的一種利用離子液體和蛋白酶提取柞蠶絲絲素蛋白的方法，其特征在于，步驟5）中，滅酶時，在80℃以上的油浴中保溫至少30min。

7.如權利要求1所述的一種利用離子液體和蛋白酶提取柞蠶絲絲素蛋白的方法，其特征在于，步驟6）中，所述透析袋的截留分子量為3500。