[發明專利]一種柞蠶絲素蛋白單克隆抗體的制備方法

有效

• 申請號: 201710626795.0
• 申請日: 2017-07-28
• 公開（公告）號: CN107266569B
• 公開（公告）日: 2021-04-06
• 發明（設計）人: 王秉;李津;梁軍龍;陳茹茹;陳博逸
• 申請（專利權）人: 浙江理工大學
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;G01N33/68;G01N33/577
• 代理公司: 嘉興永航專利代理事務所(普通合伙) 33265
• 代理人: 江程鵬

本發明涉及考古檢測領域，公開了一種柞蠶絲素蛋白單克隆抗體的制備方法，采用FeCl₂和亞氨基二琥珀酸四鈉混合溶液體系提取柞蠶絲素蛋白，然后將柞蠶絲素蛋白作為完全抗原注射到兔體內，選出免疫效價高的兔，將其脾淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，得到的雜交瘤細胞經培養后用間接ELISA法選出分泌抗體呈陽性，抗體分泌能力強，細胞生長狀態良好的菌株，用有限稀釋法克隆至有雜交瘤細胞生長的抗體分泌陽性率為100%為止，用篩選出的細胞進行大轉生產，然后利用層析柱對所得單抗進行純化。本發明方法制備的抗體具有很強的特異性，且其在應用過程中操作簡單快捷，檢測準確性高。

技術領域

本發明涉及考古檢測領域，尤其涉及一種柞蠶絲素蛋白單克隆抗體的制備方法。

背景技術

蠶絲是一種天然高分子蛋白質纖維，主要分為家蠶絲和柞蠶絲兩大類。我國是最早利用柞蠶和放養柞蠶的國家，但其起源問題一直籠罩在迷霧中，迫切需要一種更科學的方法來鑒定出土的絲織品。蠶絲的常規檢測方法主要有傅里葉紅外光譜、拉曼光譜、X-射線衍射等，但蠶絲長期處于墓葬或遺址環境中會受到多種因素影響，從而出現蛋白質降解及大分子鏈斷裂等問題，采用傳統的一些方法很難檢測到絲素蛋白的存在。因此如何采用自然科學的先進手段，建立絲織品微痕檢測技術體系，從印痕，殘留物，土壤中提取古代絲綢的信息，對研究絲綢的起源至關重要。當前蛋白質檢測的先進技術是基于抗體-抗原的Western Blotting或ELISA法，柞蠶絲素蛋白抗體的制備是該研究的一個關鍵環節。目前已出現了柞蠶絲素蛋白的多克隆抗體，抗體的特異性取決于抗原分子的決定簇，抗原分子具有很多抗原決定簇，因此免疫動物產生的抗體為多種抗體的混合物，要把這些不同的抗體分開十分困難，同時多克隆抗體存在純度低、理化性狀不均一、與抗原結合特異性不強等問題。

發明內容

為了解決上述技術問題，本發明提供了一種柞蠶絲素蛋白單克隆抗體的制備方法。本發明方法制備的抗體具有很強的特異性，且其在應用過程中操作簡單快捷，檢測準確性高。

本發明的具體技術方案為：一種柞蠶絲素蛋白單克隆抗體的制備方法，包括以下步驟：

A）稱取柞蠶絲并將其以1:23-27的浴比添加至去離子水中，用鹽酸調節pH至2.5-3.0，于98-102℃水浴中恒溫加熱55-65min進行脫膠，然后加入NaHCO₃調節pH至中性，按上述方法至少重復脫膠一次；將脫膠后的柞蠶絲加入至去離子水中浸泡1.5-2.5h，然后在55-65℃下烘干，制得柞蠶絲素蛋白樣品。

B）稱取9-11 g FeCl₂，加入48-52mL去離子水溶解后再滴加14-16 mL的亞氨基二琥珀酸四鈉，充分混合后定容至100 mL，得到混合溶液。

本發明采取FeCl₂與亞氨基二琥珀酸四鈉混合配比溶液較現有方法具有以下優點：易生物降解，對生態系統無毒無害；亞氨基二琥珀酸四鈉對金屬離子螯合能力強使試劑對蛋白質的提取效果更優。

C）將步驟A）所得柞蠶絲素蛋白樣品按固液比0.9-1.1g/15mL加入到步驟B）所得混合溶液中，在55-65℃水浴中攪拌保溫55-65min，取出待冷卻后，將溶液置于45-55kHz的超聲波下處理25-35min，同時用乙酸緩慢調節pH為8.5-9.0；然后將溶液裝入透析袋中進行透析，每2.5-3.5h換一次水值至袋內溶液pH小于7，將袋內溶液冷凍干燥后得到純化的柞蠶絲素蛋白，磨粉后制得柞蠶絲素蛋白完全抗原，備用。

本發明在提取過程中使用超聲處理，與傳統方法相比就具有提取得率更高和生產周期更短的優點。