[發明專利]一種柞蠶絲素蛋白單克隆抗體的制備方法

有效

• 申請號: 201710626795.0
• 申請日: 2017-07-28
• 公開（公告）號: CN107266569B
• 公開（公告）日: 2021-04-06
• 發明（設計）人: 王秉;李津;梁軍龍;陳茹茹;陳博逸
• 申請（專利權）人: 浙江理工大學
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;G01N33/68;G01N33/577
• 代理公司: 嘉興永航專利代理事務所(普通合伙) 33265
• 代理人: 江程鵬

1.一種柞蠶絲素蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

A）稱取柞蠶絲并將其以1:23-27的浴比添加至去離子水中，用鹽酸調節pH至2.5-3.0，于98-102℃水浴中恒溫加熱55-65min進行脫膠，然后加入NaHCO₃調節pH至中性，按上述方法至少重復脫膠一次；將脫膠后的柞蠶絲加入至去離子水中浸泡1.5-2.5h，然后在55-65℃下烘干，制得柞蠶絲素蛋白樣品；

B）稱取9-11 g FeCl₂，加入48-52mL去離子水溶解后再滴加14-16 mL的亞氨基二琥珀酸四鈉，充分混合后定容至100 mL，得到混合溶液；

C）將步驟A）所得柞蠶絲素蛋白樣品按固液比0.9-1.1g/15mL加入到步驟B）所得混合溶液中，在55-65℃水浴中攪拌保溫55-65min，取出待冷卻后，將溶液置于45-55kHz的超聲波下處理25-35min，同時用乙酸緩慢調節pH為8.5-9.0；然后將溶液裝入透析袋中進行透析，每2.5-3.5h換一次水直 至袋內溶液pH小于7，將袋內溶液冷凍干燥后得到純化的柞蠶絲素蛋白，磨粉后制得柞蠶絲素蛋白完全抗原，備用；

D）用生理鹽水溶解步驟C）所得柞蠶絲素蛋白完全抗原，控制濃度為1-2 mg/mL，然后與QuickAntibody-Rabbit8W按體積比0.9-1.1:1混合，制得抗原佐劑混合溶液；選取2只的大白兔進行初次免疫，用抗原佐劑混合溶液對每只兔的后大腿和皮下進行多點注射；在完成初次免疫后的第3周使用同樣的抗原佐劑混合溶液對兔子進行皮下多點注射，進行加強免疫；第5周選取免疫后效價相對較高的大白兔進入單克隆抗體制備；

E）用0.4-0.6 mg步驟C）所得柞蠶絲素蛋白完全抗原對選取的大兔進行靜脈注射，7天后在無菌條件下取出脾臟，在無菌培養皿中將脾臟清理干凈，用1640培養液沖洗，將洗凈后的脾臟放入無菌皿中，加入1640培養液10 mL，將脾臟碾碎過篩網，然后用1640培養液懸浮，在10000-14000 rpm下離心4-6 min，移除上清液，再洗滌一次，得到細胞懸液，并將其濃度稀釋為含有1×10⁸個脾淋巴細胞的懸液，備用，在細胞融合試驗前5天，另行取骨髓瘤細胞進行傳代培養；

F）取步驟E）培養得到的脾淋巴細胞和骨髓瘤細胞按1.8-2.2:1的數量比混勻，加培養液后在10000-14000 rpm下離心4-6 min，棄上清液，在35-39℃水浴中恒溫加熱，并緩緩加入聚乙二醇-1500，再加入1640培養液稀釋，在10000-14000 rpm下離心，棄上清液后將細胞用20%HAT選擇培養液懸浮；

G）步驟F）所得細胞融合10天后，用間接ELISA法選出分泌抗體呈陽性，抗體分泌能力強，細胞生長狀態良好的雜交瘤細胞，用HAT培養基擴大培養后，用有限稀釋法在96孔板內進行克隆化，選擇單個細胞集落孔的培養上清作抗體檢測，陽性者用同樣方法再次克隆，直至克隆后有雜交瘤細胞生長的抗體分泌陽性率為100%，利用篩選出的細胞進行大轉生產，收集兔單克隆抗體進入純化階段；

H）pH 7.4的PBS溶液的制備；

I）對步驟G）所得兔單克隆抗體進行純化：用10 mL，0.5 mol/L的NaCl溶液和10 mL，0.05 mol/L，pH 7.4的PBS溶液對蛋白柱進行清洗，清洗流速為58-62 mL/h；用30mL，0.05mol/L，pH 7.4的PBS溶液將收集到的兔單克隆抗體稀釋，稀釋后上樣，重復上樣一次；用20mL，0.05 mol/L，pH 7.4的PBS溶液清洗柱子，清洗的流速為115-125 mL/h，使其在280nm處的紫外吸收接近基線；用0.5 mol/L的NaCl溶液和0.05 mol/L，pH 7.4的PBS溶液進行洗脫；洗脫完成后用0.05 mol/L，pH 7.4的PBS溶液洗滌多肽柱，獲得純化后的柞蠶絲素蛋白單克隆抗體，在1-5℃下儲存備用。

2.如權利要求1所述的一種柞蠶絲素蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于，步驟C）中，所述透析袋的規格為截留分子量8000。

3.如權利要求1所述的一種柞蠶絲素蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于，步驟D）中，所述大白兔為14-16周齡。