[發明專利]使用透化處理的細胞過濾小核酸

在審

• 申請號: 201710626674.6
• 申請日: 2012-08-02
• 公開（公告）號: CN107400711A
• 公開（公告）日: 2017-11-28
• 發明（設計）人: 孔艷紅;史蒂文·T·奧基諾;孟祥棟
• 申請（專利權）人: 伯樂實驗室公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司11021
• 代理人: 張國梁

本申請是PCT申請號為PCT/US2012/049344，中國國家階段申請號為201280038451.3的發明專利申請的分案申請。原申請的發明名稱為“使用透化處理的細胞過濾小核酸”，申請日為2012年8月2日。

相關專利申請的交叉參考

本專利申請要求于2011年8月3日提交的美國臨時專利申請號61/514,711和于2011年12月14日提交的61/570,581的優先權利益，這兩份美國臨時專利申請通過引用分別并入本文。

發明背景

染色質分類成兩個大組：常染色質，其中DNA是松散包裝的、可及的(accessible)，并且通常但不總是能夠轉錄的，和異染色質，其中DNA是緊密包裝的、不可及的，并且通常但不總是轉錄沉默的。

表觀遺傳學控制在這兩種染色質狀態之間的至少一些轉換。存在至少兩種主要的表觀遺傳學事件：DNA甲基化和組蛋白修飾。這些事件影響DNA如何包裝，并且影響DNA是轉錄活性的還是沉默的。

發明簡述

本發明提供，例如，將透化處理的細胞中DNA切割劑可及的DNA與DNA切割劑不可及的DNA分離的方法。在一些實施方案中，該方法包括：透化處理具有基因組DNA的細胞，由此產生透化處理的細胞；在使得DNA切割劑切割細胞中的基因組DNA的條件下向所述具有基因組DNA的透化處理的細胞中引入DNA切割劑，由此產生切割的DNA；并且將從完整的透化處理的細胞中擴散出來的切割的DNA與所述細胞分離。

在一些實施方案中，所述方法還包括向所述透化處理的細胞中引入DNA修飾劑，以使所述DNA修飾劑修飾所述細胞中的基因組DNA。在一些實施方案中，所述DNA修飾劑和所述DNA切割劑被同時引入，或者所述DNA修飾劑在引入所述DNA切割劑之前引入。在一些實施方案中，所述DNA切割劑是DNA酶I或微球菌核酸酶。在一些實施方案中，所述DNA修飾劑將修飾添加到所述DNA切割劑的至少一些識別序列上，并且所述DNA切割劑不切割具有所述修飾的識別序列。在一些實施方案中，所述DNA修飾劑將修飾添加到所述DNA切割劑的至少一些識別序列上，并且所述DNA切割劑切割具有所述修飾的識別序列且不切割缺乏所述修飾的識別序列。

在一些實施方案中，所述DNA修飾劑是DNA甲基轉移酶。在一些實施方案中，所述DNA修飾劑在引入所述DNA切割劑之后引入。

在一些實施方案中，透化處理和引入同時發生。

在一些實施方案中，所述方法還包括分離所述切割的DNA。

在一些實施方案中，所述方法還包括在所述分離之后將在完整的細胞中剩余的DNA分離。

在一些實施方案中，所述細胞用透化處理劑透化處理。在一些實施方案中，細胞通過電穿孔或生物射彈法(biolistics)透化處理。在一些實施方案中，所述透化處理劑是溶血脂質(lysolipid)或非離子去污劑。

在一些實施方案中，所述DNA切割劑包括DNA酶。在一些實施方案中，所述DNA切割劑是DNA酶I或微球菌核酸酶。

在一些實施方案中，所述DNA切割劑包括限制酶。在一些實施方案中，所述限制酶是甲基化感應限制酶(methylation sensing restriction enzyme)。在一些實施方案中，所述限制酶是N⁶-甲基腺苷感應限制酶。在一些實施方案中，所述限制酶是甲基胞嘧啶感應限制酶。在一些實施方案中，所述限制酶是5-羥甲基胞嘧啶-感應限制酶。在一些實施方案中，所述限制酶切割包含5’-羥甲基胞嘧啶的識別序列。

在一些實施方案中，所述DNA切割劑包括與異源DNA識別多肽融合的DNA切割多肽。

在一些實施方案中，所述DNA切割劑包括與異源蛋白識別多肽融合的DNA切割多肽。

在一些實施方案中，所述分離包括親和純化DNA。在一些實施方案中，所述親和純化包括免疫沉淀。在一些實施方案中，DNA通過使親和劑同與DNA締合的蛋白結合而進行親和純化，由此純化蛋白和與所述蛋白締合的DNA。在一些實施方案中，所述親和劑是抗體。在一些實施方案中，所述親和劑連接到固體支持物上。在一些實施方案中，所述與DNA締合的蛋白是組蛋白，修飾的組蛋白(修飾的(例如，甲基化的)或未修飾的)，轉錄因子，RNA聚合酶或TATA盒結合蛋白(TBP)。

在一些實施方案中，所分離的DNA為約50bp至約10kb。