[發明專利]一種誘導成纖維細胞為軟骨細胞樣細胞的方法

在審

• 申請號: 201710626304.2
• 申請日: 2017-07-28
• 公開（公告）號: CN107267448A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發明（設計）人: 朱向情;潘興華;陳強
• 申請（專利權）人: 陳強
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種誘導成纖維細胞為軟骨細胞樣細胞的方法，屬于細胞生物學技術和再生醫學領域。

背景技術

軟骨組織（Cartilage tissue）是一種富含蛋白多糖、膠原和透明質酸等物質的組織，由軟骨細胞和軟骨基質構成，在體內主要起支撐和減少摩擦的作用。但軟骨組織缺乏血管，因此，軟骨組織一旦受到損傷便很難修復，即便是微小的軟骨組織損傷，也很難自然修復。

目前，臨床上用于軟骨組織損傷修復的方法主要有軟骨和軟骨下骨去除、微骨折和軟骨下骨鉆孔、自體骨軟骨移植和同種異體骨軟骨移植、軟骨或骨膜移植等（劉效仿，等. 中華創傷骨科雜志，2014,16(6):537-539）。這些方法在一定程度上均能夠對軟骨組織損傷進行修復，但均存在明顯缺點，如微骨折和軟骨下骨鉆孔方法能夠使干細胞到達損傷部位，但因局部環境和機械應力不同，干細胞很難向軟骨細胞分化；自體骨軟骨移植安全、有效，但會給患者帶來新的創傷；異體骨軟骨移植避免了自體骨軟骨移植給患者帶來的新的創傷，但存在供體來源限制、免疫排斥反應和疾病傳播風險等。

軟骨組織工程技術的發展為軟骨組織損傷的治療提供了一種新的思路和策略（Vacanti CA, et al., Plast Reconstr Surg, 1991, 88(5): 753-759; Cao Y, et al., Transplant Proc, 1994, 26(6): 3390-3392）。在軟骨組織工程中，種子細胞是其最基本的要素之一。目前，用于軟骨組織工程的細胞主要有自體或異體軟骨細胞、基因修飾細胞、胚胎干細胞、間充質干細胞等。自體軟骨細胞移植不存在免疫排斥反應，無需誘導分化培養即可直接使用，是最佳的軟骨組織工程種子細胞，但取材受限，細胞增殖能力低，體外培養易于失去原有表型（Marlovits S, et al., J Bone Joint Surg, 2004, 86(5):286-295）；同種異體軟骨細胞是自體軟骨細胞移植較好的替代細胞，避免了自體軟骨細胞采集造成的新的創傷，但供體來源受限，存在疾病傳播風險；基因修飾細胞可通過基因工程技術將細胞因子基因導入軟骨細胞內，使其在軟骨損傷部位表達細胞因子，促進軟骨損傷修復（Sellers RS, et al., J Bone Joint Surg, 2002, 79(6):1452-1463），但基因導入可能存在潛在安全風險；胚胎干細胞的分化潛能最為全面，但其免疫原性也最差，在體內易形成畸胎瘤，且涉及嚴重的倫理爭議；間充質干細胞的組織分布雖較為廣泛，但其數量比例較低以及分化能力常受限制（Covas D, et al., Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 2003, 36(9): 1179-1183; Kestendjieva S, et al., Cell biology international, 2008, 32(7): 724-732; Yamazaki H, et al., Stem Cells, 2007, 25(1): 78-87）。

重編程技術以及譜系重編程技術（Lineage reprogramming）的發展為軟骨細胞的來源開辟了新的途徑。所謂重編程技術是將成熟的成體細胞先轉變為誘導多能干細胞（Induced pluripotent stem cells, iPSCs），然后再進一步分化為其它類型的細胞，而譜系重編程技術則是不經過多能干細胞階段，直接將成體細胞直接轉分化為另一類型的細胞。目前，科學家已利用誘導多能干細胞分化出了骨和軟骨組織（Hong SG, et al., Cell Reports, 2014 , 7 (4) :1298-1309），但是，目前重編程和譜系重編程技術最為有效的方法是基于載體的轉錄因子介導方法，由于該方法涉及基因導入，所以存在潛在的安全隱患，因此在臨床應用上需嚴格限制。

綜合以上分析，軟骨組織損傷修復仍存在諸多問題，特別是用于損傷修復的種子細胞來源問題，仍需尋找一種獲得方法相對簡單、安全性相對較好的成體細胞分化為軟骨細胞的方法。基于此，本發明嘗試建立了一種利用魚卵母細胞提取物誘導成纖維細胞為軟骨細胞樣細胞的方法（鑒于學術嚴謹性，誘導的軟骨細胞和正常軟骨細胞在表觀遺傳模式方面可能不完全相同，因此，本發明專利將誘導后阿利新藍陽性染色的細胞稱為軟骨細胞樣細胞）。本發明方法所有步驟均不涉及基因導入操作，產生的軟骨細胞樣細胞安全性較好，實驗操作相對簡單，實驗的重復性也較好。

發明內容