[發(fā)明專利]一種誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞為軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710626304.2
• 申請(qǐng)日: 2017-07-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107267448A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-10-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱向情;潘興華;陳強(qiáng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 陳強(qiáng)
• 主分類號(hào): C12N5/077
• 分類號(hào): C12N5/077
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞為軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞的方法，其特征在于包括如下步驟：

（1）誘導(dǎo)劑的制備，誘導(dǎo)劑為魚卵母細(xì)胞提取物，優(yōu)選卵黃充滿時(shí)相時(shí)期的鯽魚，在無(wú)菌和低溫條件下，取出魚卵進(jìn)行研磨、過(guò)濾，制備出用于成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)的魚卵母細(xì)胞提取物；

（2）成纖維細(xì)胞的制備，無(wú)菌條件下將人或動(dòng)物的皮膚組織充分剪碎，在含有氨芐青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行原代和傳代培養(yǎng)，獲得用于誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞；

（3）成纖維細(xì)胞的誘導(dǎo)，利用所述步驟（1）中制備的誘導(dǎo)劑對(duì)所述步驟（2）中制備的成纖維細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，使成纖維細(xì)胞向誘導(dǎo)多能干細(xì)胞轉(zhuǎn)變；

（4）誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的鑒定，利用免疫組化方法，根據(jù)Sox2、Nanog和Oct4/3基因表達(dá)情況對(duì)成纖維細(xì)胞的誘導(dǎo)情況進(jìn)行鑒定；

（5）誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞的誘導(dǎo)，將所述步驟（3）中誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞和經(jīng)過(guò)所述步驟（4）鑒定誘導(dǎo)成功的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)；

（6）軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞的鑒定，利用阿利新藍(lán)染色和HE染色方法鑒定所述步驟（5）中誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞的分化情況。

2.一種采用權(quán)利要求1所述一種誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞為軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞的方法，其特征在于，所述步驟（1）中制備的魚卵母細(xì)胞提取液儲(chǔ)存濃度為10mg/ml，儲(chǔ)存條件為4℃。

3.一種采用權(quán)利要求1所述一種誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞為軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞的方法，其特征在于，所述步驟（2）中用于培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)基包含100U/ml氨芐青霉素和100mg/ml的鏈霉素。

4.一種采用權(quán)利要求1所述一種誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞為軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞的方法，其特征在于，所述步驟（3）中使用的魚卵母細(xì)胞提取物終濃度為10~20μg/ml，使用的成纖維細(xì)胞為培養(yǎng)的第四代動(dòng)物成纖維細(xì)胞，成纖維細(xì)胞在添加魚卵母細(xì)胞提取物的培養(yǎng)基中的誘導(dǎo)時(shí)間為72小時(shí)。

5.一種采用權(quán)利要求1所述一種誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞為軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞的方法，其特征在于，所述步驟（4）中誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的鑒定采用人抗Sox2、Nanog和Oct4/3抗體。

6.一種采用權(quán)利要求1所述一種誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞為軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞的方法，其特征在于，所述步驟（5）中軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基組份包括：高糖DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、10nM地塞米松、100mg/ml丙酮酸鈉、10ng/ml TGF-β3、50mg/ml抗壞血酸、40mg/ml脯氨酸和ITS添加物，ITS添加物組份為：終濃度分別為6.25mg/ml牛胰島素、6.25mg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、6.25mg/ml硒酸、5.33mg/ml亞油酸、1.25mg/ml牛血清白蛋白。

7.一種采用權(quán)利要求1所述一種誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞為軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞的方法，其特征在于，所述步驟（6）中軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞鑒定使用的阿利新藍(lán)染液pH值為1.0。