[發明專利]一種CAR-NK細胞及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201710626029.4
• 申請日: 2017-07-27
• 公開（公告）號: CN108300698B
• 公開（公告）日: 2020-07-03
• 發明（設計）人: 王旭;李陶;林詞雄;林潔璇;朱剛
• 申請（專利權）人: 沃昕生物科技（深圳）有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;C12N15/62;A61K35/17;A61P35/00
• 代理公司: 北京睿派知識產權代理事務所(普通合伙) 11597
• 代理人: 劉鋒

1.一種CAR-NK細胞的制備方法，其特征在于：所述制備方法包括以下步驟；

S1：以FcεRIγ的胞內信號段作為CAR的胞內信號段，以CD28作為跨膜區，4-1BB為共刺激因子，構建靶向CD19的CAR，并人工合成CAR序列CD19scFv--CD28--4-1BB--FcεRIγ；

S2：將步驟S1中所合成的CAR序列CD19scFv--CD28--4-1BB--FcεRIγ整合進慢病毒目的載體質粒中，得到目的質粒；

S3：取對數生長期的細胞接種于細胞培養皿中；將步驟S2中所得到的目的質粒連同包裝質粒和包膜質粒一同加入所述細胞中包裝出病毒，最后收集病毒液，濃縮，檢測濃縮病毒的滴度，即得目的質粒的病毒濃縮液；

S4：①取外周血進行離心，收集分離液上層的自體血漿并進行滅活，并收集吸取中間云霧層細胞即分離外周血單個核細胞PBMC，洗滌，將自體血漿與單個核細胞PBMC混合，并用活化培養基調整細胞密度為(1～3)×10⁶個/ml，然后進行細胞培養8～12天；②將①中整個細胞培養體系一起轉移到新的細胞培養袋中繼續培養4～10天，并在后續培養過程中補充增殖培養基，補充增殖培養基時維持細胞密度為(1～2)×10⁷個/ml；③培養完畢后，檢測NK細胞表型，CD3-CD16+CD56+細胞比例達88％，無需分選，直接用于CAR-NK的制備；

S5：取步驟S4中培養完畢后的NK細胞，分別加入步驟S3中所得到的目的質粒的病毒濃縮液，加入改良型的多肽，使其終濃度為20～70ng/μL；然后在37℃孵育4-6h后，收集細胞，600～1000g/min離心4～7min，棄病毒液，PBS洗滌，1640培養基重懸細胞，得到CAR-NK細胞；所述改良型的多肽的序列為：Ac-KKKNWFDWTNWLWYWK-NH2；其中，步驟S2中，所述目的載體質粒為pWPXL-GFP，整合CAR序列后所得的目的質粒記為pWPXL-FcεRIγ。

2.根據權利要求1所述的CAR-NK細胞的制備方法，其特征在于：在步驟S3中，所述細胞為293T細胞，該293T細胞的接種于細胞培養皿中的量為(4～6)x10⁶個；然后在步驟S2中所得到的目的質粒中加入CaCl₂，得混合液，并將該混合液加入293T細胞中，在培養箱中培養以使慢病毒包裝。

3.根據權利要求2所述的CAR-NK細胞的制備方法，其特征在于：步驟S3中，慢病毒包裝的具體方法為：

(1)取400～500μl ddH₂O加入無菌EP管中，并加入目的質粒8～12μg、包裝質粒5～8μg和包膜質粒3～4μg；所述目的質粒為pWPXL-FcεRIγ；

(2)緩慢加入45～55μl CaCl₂，輕輕混勻，得混合液；然后將含有CaCl₂和質粒的混合液加入到2x HBS中，輕輕混勻，室溫靜置10～20min；

(3)取對數生長期293T細胞(4～6)x10⁶個接種于細胞培養皿中，24h后待細胞融合度達80％時，更換為新鮮的DMEM完全培養基；

(4)將步驟(2)中所得的混合液加入到步驟(3)所得的接種有293T細胞的DMEM完全培養基中，37℃、5％CO₂培養箱中培養；

(5)24h后待細胞融合度達80％時，更換為新鮮培養基，繼續培養；

(6)48h后收集第一批病毒液，并加入新鮮培養基繼續培養；

(7)72h后收集第二批病毒液；

(8)將收集的病毒液置于超濾管中，濃縮，收集病毒濃縮液，-80℃保存備用；

(9)倍數稀釋法檢測濃縮病毒的滴度。

4.根據權利要求3所述的CAR-NK細胞的制備方法，其特征在于：步驟(1)中，所加入的包裝質粒為質粒PMD2.G，所述包膜質粒為質粒PSPAX2。