[發明專利]一種CAR-NK細胞及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201710626029.4
• 申請日: 2017-07-27
• 公開（公告）號: CN108300698B
• 公開（公告）日: 2020-07-03
• 發明（設計）人: 王旭;李陶;林詞雄;林潔璇;朱剛
• 申請（專利權）人: 沃昕生物科技（深圳）有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;C12N15/62;A61K35/17;A61P35/00
• 代理公司: 北京睿派知識產權代理事務所(普通合伙) 11597
• 代理人: 劉鋒

本發明涉及一種CAR?NK細胞及其制備方法與應用，包括：S1：合成CAR序列；S2：將其整合進慢病毒目的載體質粒中，得到目的質粒；S3：將目的質粒與293T細胞混合并進行培養，收集病毒液，濃縮，得目的質粒的病毒濃縮液；S4：收集自體血漿以及外周血單個核細胞PBMC，用活化培養基調整細胞密度并進行細胞培養；轉移到新的細胞培養袋中繼續培養，并補充增殖培養基；培養完畢后得到NK細胞；S5：在NK細胞中加入目的質粒的病毒濃縮液進行孵育，得到CAR?NK細胞。本發明的CAR?NK細胞具有非常強的因子分泌能力和抑瘤能力，且制備CAR?NK細胞的轉染方法高效、穩定。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種CAR-NK細胞及其制備方法與應用。

背景技術

自然殺傷細胞(Nature killer cell,NK細胞)是一種機體內重要的天然免疫系統淋巴細胞。其表型一般為CD3-CD16+CD56+，主要來源于骨髓CD34+淋巴細胞。NK細胞不受MHC的限制，無需抗原致敏即可以識別并且殺傷腫瘤細胞。同時，NK細胞可以分泌多種細胞因子來調節獲得性免疫應答，是連接固有免疫應答和獲得性免疫應答的橋梁，所以NK細胞在抗腫瘤和抗病毒感染的免疫應答中起重要作用，被稱為人類健康的第一道防線。

NK細胞對腫瘤細胞的識別主要依賴于細胞表面的受體，而不受MHC限制。當識別腫瘤細胞之后，NK細胞通過釋放穿孔素和顆粒酶使腫瘤細胞凋亡。除此之外，NK細胞還可以通過TNF凋亡信號通路和抗體依賴的細胞毒作用等多種途徑殺傷腫瘤細胞。但是，由于腫瘤逃逸機制的存在，以及患者體內NK細胞數量、質量的下降等原因，NK細胞在體內的抗腫瘤功能未能得到充分發揮。

近年來，嵌合抗原受體(Chimeric antigen receptor，CAR)修飾的T細胞(CAT-T)在血液腫瘤研究中取得了重大的技術突破，為人類攻克癌癥帶來了新的希望。但是，CAR-T療法也存在著一些目前難以克服的問題，比如對實體瘤療效不顯著、細胞因子風暴、脫靶效應、插入突變等。因此，研發新型的具有強大抗腫瘤效應的細胞具有極其重要的理論和應用價值。NK細胞因其特殊的靶細胞識別機制、廣譜抗瘤能力等優勢，被視為有潛力通過CAR修飾來增強其抗腫瘤效應的細胞。通過CAR修飾NK細胞有望增強其靶向殺傷腫瘤細胞的能力。

CAR修飾NK細胞的目的是通過基因編輯技術來建立一條活化NK細胞的激活通路并增強其靶向抗腫瘤效應。CAR-NK的基本結構框架和轉染方式均源于CAR-T。CAR的主要結構同樣包括胞外抗原結合區、跨膜區和胞內信號區，這三部分構成的基本結構框架決定了CAR-NK的特異性和功能性。胞外抗原結合區主要由單鏈可變區片段(Single-chainvariable fragment，scFv)組成，能夠識別腫瘤細胞表面表達的腫瘤相關抗原并與其結合，是決定CAR-NK細胞靶向性的關鍵所在。目前，應用于CAR-T的scFv均可直接應用于CAR-NK，如CD19、Her2、CD20等。跨膜區是將膜外信號傳導到細胞內，與CAR-T類似，常用的跨膜區為CD3ζ和CD8的跨膜序列。胞內信號區含有免疫受體酪氨酸活化基序(ITAM)，其組成為D/ExxYxxL/I，是CAR-NK和CAR-T細胞活化信號強弱的關鍵。當胞外抗原識別區與腫瘤相關抗原相互作用時，ITAM被鉻氨酸激酶磷酸化而傳遞胞外的活化信號。在CAR-T細胞中，CD3ζ胞內信號段是最經典，也是最常用的胞內信號段。目前，CAR-NK中所用到的CAR的結構模式基本沿用的是CAR-T的設計，包括胞外抗原結合區、跨膜區和胞內信號區，未能充分發揮NK細胞的特點。因此，根據NK細胞的特點，有針對性的設計CAR就顯得尤為必要。

另一方面，CAR-NK除了基本結構繼承了CAR-T外，其轉染方式也與CAR-T一致。事實上，NK細胞比T細胞更難以轉染。脂質體轉染和電穿孔轉染的轉導效率均不足10％，慢病毒轉染的效率為12％～73％，并不穩定。事實上，目前有研究報道一些細胞因子和多肽可以促進慢病毒對NK細胞的轉染效率，如IL-15等。