[發明專利]柑橘類病毒cDNA二聚體及其侵染性克隆的快速制備新方法

在審

• 申請號: 201710624692.0
• 申請日: 2017-07-27
• 公開（公告）號: CN107287193A
• 公開（公告）日: 2017-10-24
• 發明（設計）人: 曹孟籍;王亞飛;周常勇
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/63;C12R1/93
• 代理公司: 重慶市前沿專利事務所(普通合伙)50211
• 代理人: 鄒曉艷

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，涉及一種柑橘類病毒cDNA二聚體及其侵染性克隆的快速制備新方法。

背景技術

類病毒是一類246～401-nt大小的閉合環狀的單鏈小分子RNA，能在敏感寄主上引發嚴重病癥，是一種重要的植物病原物。柑橘裂皮類病毒(Citrus exocortis viroid,CEVd)屬于馬鈴薯塊莖類病毒科(Pospiviroidae)馬鈴薯塊莖類病毒屬(Pospiviroid)，是柑橘裂皮病的病原，可在枳和枳橙砧木上引起嚴重的裂皮癥狀，是威脅世界柑橘產業發展的重要病害之一。柑橘樹皮裂紋類病毒(Citrus bark cracking viroid,CBCVd)屬于馬鈴薯塊莖類病毒科(Pospiviroidae)椰子死亡類病毒屬(Cocadviroid)，可在無CEVd的情況下與其他柑橘類病毒復合侵染枳橙砧木引起類似柑橘裂皮病的癥狀。由CBCVd引起的啤酒花矮縮病是啤酒花上一種毀滅性病害，癥狀包括葉片卷曲，黃化，過早開花和球果尺寸變小，干根腐爛，植株發育遲緩甚至死亡。

另外，前人研究表明，CEVd和CBCVd在某些敏感寄主上存在交叉保護現象，然研究者對其互作機理尚不清楚。兩種類病毒復合侵染能明顯降低CEVd在敏感砧木上的癥狀，這為預防柑橘裂皮病提供了交叉保護的新思路。最近研究表明，來源于類病毒的小RNA在類病毒致病性上扮演了重要角色。前期研究表明，由CEVd和CBCVd負鏈產生的小RNA主要來自于兩者基因組具有高度序列同源性的區域，分析交叉保護現象與這些小RNA可能有緊密聯系。

方便快捷的植物病原物侵染性克隆構建方法，是研究病原致病性的基礎和保證，可用于植物和病原之間的互作，外源基因的表達以及由其引起的基因沉默研究等。類病毒侵染性克隆的構建方法可廣泛應用在其侵染性研究，癥狀分析，致病性研究，以及類病毒在寄主中的移動途徑研究等。

傳統的類病毒構建方法操作步驟繁瑣，耗時費力，且所用載體和試劑復雜多樣，成本較高。以下是常見的類病毒侵染性克隆構建方法：選擇合適的酶切位點設計引物擴增類病毒全長目標片段，克隆測序后篩選優勢序列用于構建侵染性克隆，通常選用pGEM-T載體，類病毒單體質粒構建完成后進行酶切并回收目的片段和載體(目的片段用于連接成二聚體，回收載體經脫磷后與二聚體進行連接)。將回收的單體片段加入連接酶后進行連接，得到含有類病毒全長二聚體的連接混合液，向此混合液中加入回收并且脫磷的載體，再一次進行連接處理。之后轉化連接產物，涂板培養后挑選單克隆進行酶切或者菌液PCR鑒定，最后通過測序鑒定是否得到正確的二聚體重組質粒。根據插入片段的方向，選擇合適的酶進行單酶切，使用RNA聚合酶體外轉錄目標片段獲得具有侵染活性的類病毒二聚體RNA。

發明內容

本發明的目的在于針對上述技術問題，提供一種柑橘類病毒cDNA二聚體及其侵染性克隆的快速制備新方法。

本發明實現其目的的技術方案為：

一種柑橘類病毒cDNA二聚體的快速制備新方法，包括如下步驟：

(1)提取柑橘類病毒的總RNA；

(2)利用一步法RT-PCR對提取的總RNA進行擴增，PCR反應體系包括：PrimeScript 1step Enzyme Mix、MgCl₂、類病毒全長擴增引物、總RNA、無RNA酶的水；擴增完畢即得柑橘類病毒cDNA二聚體。

在上述技術方案中，所述的柑橘類病毒為CEVd，使用的類病毒全長擴增引物對為：CEVd-For/CEVd-Rev，引物序列為CEVd-For：5'-ggaaacctggaggaagtcgag-3'，CEVd-Rev：5'-ccggggatccctgaaggactt-3'。

在上述技術方案中，所述的PCR反應體系總體積為25ul，由如下組分組成：2×one-step Buffer 12.5ul、25mM的MgCl₂ 3～5ul、10uM的CEVd-For 0.4～0.6ul、10uM的CEVd-Rev 0.4～0.6ul、PrimeScript 1step Enzyme Mix 0.2～1ul、總RNA100～1000ng，余量為無RNA酶的水。

在上述技術方案中，PCR反應條件為：50℃反轉錄30min；95℃酶滅活3min；然后95℃/30s，58℃/30s，68℃/1min，35個循環；最后68℃延伸10min。