[發(fā)明專利]柑橘類病毒cDNA二聚體及其侵染性克隆的快速制備新方法

在審

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• 申請日: 2017-07-27
• 公開（公告）號: CN107287193A
• 公開（公告）日: 2017-10-24
• 發(fā)明（設計）人: 曹孟籍;王亞飛;周常勇
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/63;C12R1/93
• 代理公司: 重慶市前沿專利事務所(普通合伙)50211
• 代理人: 鄒曉艷

1.一種柑橘類病毒cDNA二聚體的快速制備新方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)提取柑橘類病毒的總RNA；

(2)利用一步法RT-PCR對提取的總RNA進行擴增，PCR反應體系包括：PrimeScript 1step Enzyme Mix、MgCl₂、類病毒全長擴增引物、總RNA、無RNA酶的水；擴增完畢即得柑橘類病毒cDNA二聚體。

2.如權利要求1所述的柑橘類病毒cDNA二聚體的快速制備新方法，其特征在于，所述的柑橘類病毒為CEVd，使用的類病毒全長擴增引物對為：CEVd-For/CEVd-Rev，引物序列為CEVd-For：5'-ggaaacctggaggaagtcgag-3'，CEVd-Rev：5'-ccggggatccctgaaggactt-3'。

3.如權利要求2所述的柑橘類病毒cDNA二聚體的快速制備新方法，其特征在于，所述的PCR反應體系總體積為25ul，由如下組分組成：2×one-step Buffer 12.5ul、25mM的MgCl₂3～5ul、10uM的CEVd-For 0.4～0.6ul、10uM的CEVd-Rev 0.4～0.6ul、PrimeScript 1 step Enzyme Mix 0.2～1ul、總RNA 100～1000ng，余量為無RNA酶的水。

4.如權利要求3所述的柑橘類病毒cDNA二聚體的快速制備新方法，其特征在于，PCR反應條件為：50℃反轉錄30min；95℃酶滅活3min；然后95℃/30s，58℃/30s，68℃/1min，35個循環(huán)；最后68℃延伸10min。

5.如權利要求1所述的柑橘類病毒cDNA二聚體的快速制備新方法，其特征在于，所述的柑橘類病毒為CBCVd，使用的類病毒全長擴增引物對為：CBCVd-For/CBCVd-Rev，引物序列為CBCVd-For：5'-ggggaaatctcttcagac-3'，CBCVd-Rev：5'-ggggatccctcttcaggt-3'。

6.如權利要求5所述的柑橘類病毒cDNA二聚體的快速制備新方法，其特征在于，在利用總RNA進行一步法RT-PCR擴增之前，先將總RNA進行高溫解鏈處理。

7.如權利要求5所述的柑橘類病毒cDNA二聚體的快速制備新方法，其特征在于，所述的PCR反應體系總體積為25ul，由如下組分組成：2×one-step Buffer 12.5ul、25mM的MgCl₂3～5ul、10uM的CBCVd-For 0.4～0.6ul、10uM的CBCVd-Rev 0.4～0.6ul、PrimeScript 1 step Enzyme Mix 0.5ul、總RNA 100～1000ng，余量為無RNA酶的水。

8.如權利要求7所述的柑橘類病毒cDNA二聚體的快速制備新方法，其特征在于，PCR反應條件為：55℃反轉錄30min；94℃酶滅活3min；然后94℃/30s，58℃/30s，68℃/45min，35個循環(huán)；最后68℃延伸7min。

9.一種柑橘類病毒侵染性克隆的快速制備新方法，其特征在于，先利用權利要求1至8任一項所述的方法制備得到柑橘類病毒cDNA二聚體，然后將該二聚體克隆進T載體，獲得包含該二聚體的連接產物，即得此柑橘類病毒的侵染性克隆。

10.如權利要求9所述的柑橘類病毒侵染性克隆的快速制備新方法，其特征在于，所述的T載體為pGEM-T easy載體。