[發明專利]一種從發酵液中提取己二酸的方法

有效

• 申請號: 201710622975.1
• 申請日: 2017-07-27
• 公開（公告）號: CN107382706B
• 公開（公告）日: 2019-09-03
• 發明（設計）人: 鄧禹;趙梅;毛銀;趙運英;盧偉強;陸春波
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C07C51/42
• 分類號: C07C51/42;C07C51/43;C07C51/47;C07C51/48;C07C55/14;C12P7/44
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發明公開了一種從發酵液中提取己二酸的方法，屬于生物工程領域。本發明的方法是將發酵液經過固液分離、超濾、濃縮、離子交換、溶液萃取、蒸發和結晶等步驟處理后，獲得成品己二酸產品。采用本發明的提取方法提取得到的己二酸收率和純度都達到較高的水平，最終收率高達71.7％，純度可達95.86％。

技術領域

本發明涉及一種從發酵液中提取己二酸的方法，屬于生物工程領域。

背景技術

己二酸(Adipic acid，adipate)又稱肥酸，是一種重要的有機二元酸，廣泛應用于化工生產、有機合成工業、醫藥、潤滑劑制造等方面。

目前己二酸的生產方式主要采用空氣氧化法或硝酸氧化法，但是此種方法的產品收率低于60％，廢水量排放量較大，原料和中間產物毒性很強，而且過程中產生大量的N₂O等溫室氣體，環境污染嚴重且不可持續。因此，人們將目光聚焦到生物合成己二酸的道路上，且做了大量的基礎工作。以葡萄糖為底物全生物合成己二酸具有工藝流程簡單、總投入成本低、可循環利用等突出優點，因此備受研究人員青睞。但是這些方法均未涉及到發酵液中己二酸的提取，在發酵液中提取己二酸主要存在的問題是發酵液中雜酸多，難以分離一種有機酸，純度無法保證。而且菌生長狀況等因素，也會導致發酵液中的有機酸提取比較困難。

本發明從葡萄糖為底物全生物合成己二酸的發酵液中提取己二酸，回收率達60％以上，純度達90％以上。方法簡單綠色，提取出來的己二酸純度高，無需二次處理，可直接使用。

發明內容

本發明的目的在于提供一種從發酵液中提取己二酸的方法，所述方法包括如下步驟：

(1)固液分離：發酵液去除菌體和雜質后，收集發酵液清液；

(2)超濾：利用超濾膜系統，將發酵液清液中的大分子蛋白及高分子雜質去除，收集超濾透過液；

(3)濃縮：濃縮超濾透過液；

(4)離子交換：將濃縮后的發酵液加入到經堿洗、去離子水洗、酸洗、去離子水洗至中性的陽離子交換樹脂中，攪拌均勻，使樹脂充分吸附后，過濾收集濾液；

(5)溶劑萃取：將收集到的濾液使用酸調節pH至酸性，然后使用有機溶劑萃取，收集萃取液；

(6)蒸發：蒸發萃取液中的有機溶劑；

(7)結晶：將旋轉蒸發剩余的液體于4-8℃低溫結晶，結晶后，于20-40℃進行完全結晶，得到己二酸成品。

在本發明的一種實施方式中，所述步驟(1)中的發酵液中己二酸含量為10-30g/L。

在本發明的一種實施方式中，所述步驟(1)中的發酵液是以重組大腸桿菌Mad2△atoB發酵得到；所述重組大腸桿菌Mad2△atoB是以敲除了atoB基因的大腸桿菌BL21(DE3)為宿主，分模塊過量表達來自褐色喜熱裂孢菌的異源基因β-酮硫解酶基因，3-羥酰基-輔酶A脫氫酶基因，3-羥基己二酰脫氫酶基因，5-羧基-2-戊烯酰輔酶A還原酶基因，己二酰輔酶A合成酶基因片段Tfu_2576、Tfu_2577；其中，β-酮硫解酶基因、3-羥酰基-輔酶A脫氫酶基因以pRSFDuet-1為表達載體；3-羥基己二酰脫氫酶基因、5-羧基-2-戊烯酰輔酶A還原酶基因以pTrc99a為表達載體；己二酰輔酶A合成酶基因片段Tfu_2576、Tfu_2577以pCDFDuet-1為表達載體。

在本發明的一種實施方式中，所述發酵液的制備是：重組大腸桿菌Mad2△atoB種子液以2％的接種量接種至裝有3L SOB培養基的5L發酵罐中，攪拌轉速400rpm，通氣量1vvm，2M NaOH維持pH為6.8～7.2，發酵溫度37℃，培養至OD₆₀₀為0.6-0.8時加1mM IPTG，降溫至30℃誘導；待發酵培養基里面的葡萄糖消耗剩2g/L左右時補加甘油，以維持甘油濃度在4g/L的速度進行補料，直至甘油補加總量達到100g/L。