[發明專利]一種基于Blocker引物和ARMS引物檢測基因突變的方法和試劑盒

有效

• 申請號: 201710620218.0
• 申請日: 2012-02-16
• 公開（公告）號: CN107419018B
• 公開（公告）日: 2020-09-04
• 發明（設計）人: 陳唯軍;劉利成;馮華華;王鵬志;劉琦;徐磊
• 申請（專利權）人: 江蘇宏微特斯醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12Q1/6886;C12N15/11
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本發明公開了一種基于Blocker引物和ARMS引物檢測基因突變的方法和試劑盒。本發明中，根據退火溫度來設計相應的blocker引物，在blocker的退火溫度下，Blocker引物與野生型模板結合，阻斷野生型的擴增，同時使用ARMS技術來降低野生型背景的擴增。本發明通過將Blocker富集技術以及ARMS熒光定量PCR技術整合在一個反應體系中，一步即可實現對突變基因的富集和鑒定，減少了操作步驟，提高了檢測靈敏度和特異性。

本申請是2012年2月16日提交、申請號201210035665.7和發明名稱為“一種基于Blocker引物和ARMS引物檢測基因突變的方法和試劑盒”申請的分案申請。

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，特別涉及一種檢測基因突變的方法和試劑盒。

背景技術

基因突變(gene mutation)是由于DNA分子中發生堿基對的增添、缺失或改變而引起的基因結構的改變?；蛲蛔兎譃閮煞N，性細胞突變以及體細胞突變。性細胞突變是指發生在性細胞的突變，是可遺傳的突變類型。除性細胞外的體細胞發生的突變不會造成后代的遺傳改變，卻可以引起當代某些細胞的遺傳結構發生改變。絕大部分體細胞突變無表型效應。體細胞突變是一種稀有突變，體細胞突變存在于大量的野生型背景DNA序列中，相對于野生型背景序列的含量，體細胞突變含量很少。如腫瘤患者組織和外周血內含有少量的腫瘤細胞DNA，初期出現的細菌和病毒耐藥情況等。體細胞突變常與疾病的發病相關，可以作為疾病發病的標志物、預后判斷的主要標志以及用藥指導的標志物。因此，體細胞突變的檢測對于疾病的診療和預后評價具有重要的意義。

肺癌是當今世界各國常見的惡性腫瘤，并已成為絕大多數國家癌癥死亡的主要原因。其中以非小細胞肺癌(NSCLC)最常見。目前靶向治療已經成為非小細胞肺癌臨床治療的重要手段。易瑞沙(Iressa/吉非替尼/Gefitinib，阿斯利康)和特羅凱(Tarceva/厄羅替尼/Erlotinib，羅氏制藥)作為表皮生長因子受體(EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(TKI)，是美國FDA批準用于NSCLC靶向治療的主要藥物。但是，臨床試驗表明易瑞沙和特羅凱僅對10-30％的NSCLC病人有顯著療效。進一步的研究發現EGFR基因突變L858R和19外顯子缺失(E746_A750)與NSCLC靶向治療的療效具有相關性，絕大多數攜帶EGFR基因突變L858R和19外顯子缺失(E746_A750)的病人療效顯著。但幾乎所有患者遲早均要發生EGFR-TKI性耐藥，中位無進展時間只有6-12個月。而EGFR-TKI耐藥存在明顯的分子靶標，即T790M。EGFR野生型基因序列見Genbank No.NM_005228.3，T790M突變即該序列中第2369個堿基C突變為T。結合EGFR基因突變的檢測信息制定出最為適合NSCLC病人個體的腫瘤治療方案，為臨床醫生用藥提供用藥科學依據，降低醫生治療風險以及患者經濟負擔。

目前體細胞突變的檢測方法主要有DNA測序法和突變體富集PCR等技術方法。DNA測序法是進行突變檢測的可靠方法，也是使用最多的方法。測序法對取材和技術要求比較高，更重要的是，由于測序方法本身的限制，靈敏度不高，只能對含量大于20％的突變基因進行檢測。突變體富集PCR是一種用限制性內切酶選擇性消化野生型基因的兩步法PCR，與測序法相比，由于突變體富集PCR有兩次PCR擴增，檢測突變靈敏性更高，特異性強更強，能從104～105個野生型拷貝中檢測到一個突變基因。該方法的主要限制因素是，合適限制性內切酶的選擇、操作復雜、耗時長、以及兩次PCR容易污染。