[發明專利]一種基于Blocker引物和ARMS引物檢測基因突變的方法和試劑盒

有效

• 申請號: 201710620218.0
• 申請日: 2012-02-16
• 公開（公告）號: CN107419018B
• 公開（公告）日: 2020-09-04
• 發明（設計）人: 陳唯軍;劉利成;馮華華;王鵬志;劉琦;徐磊
• 申請（專利權）人: 江蘇宏微特斯醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12Q1/6886;C12N15/11
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• 代理人: 暫無信息

1.一種基于Blocker引物和ARMS引物檢測基因突變的試劑盒，所述試劑盒包括樣本DNA、Blocker引物、ARMS引物、TaqMan探針、聚合酶及緩沖液，用于依次進行富集PCR反應和ARMS熒光定量PCR反應，在Blocker引物的退火溫度下，Blocker引物與野生型模板優先結合從而阻斷ARMS引物與野生型模板結合，然后在ARMS引物的退火溫度下，ARMS引物與突變型模板結合，通過PCR反應富集擴增樣本DNA中包含待測基因突變區域的片段，其中，所述Blocker引物為與所檢測突變區域的野生型序列完全互補且3’末端進行修飾以阻止其延伸的寡核苷酸，所述ARMS引物的3’末端位于突變區域處，可擴增包含待測基因突變區域的片段并且與突變型序列一致，其中，在所述ARMS引物的3’末端第2個、第3個堿基或第4個堿基處再引入一個錯配堿基，其中，所述Blocker引物在合成過程中在其序列中直接引入化學基團提高其Tm值，所述Blocker引物的退火溫度比所述ARMS引物的退火溫度高20～25℃；ARMS引物及5’端FAM標記的Taqman探針通過熒光定量PCR反應對所述突變基因進行熒光檢測；其中所述基因突變為EGFR基因點突變T790M，其中，所述Blocker引物的序列為5’-TGCAGCTCATCACGCAGCTCATG-3’ddC(SEQ ID NO:1)，上游ARMS引物的序列為：5’-CACCGTGCAGCTCATTAT-3’(SEQ ID NO:2)，下游引物的序列為：5’-CACACACCAGTTGAGCAGGTACT-3’(SEQ ID NO:3)；所述Taqman探針的序列為：5’-CCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGT-3’(SEQ ID NO:4)。

2.如權利要求1所述的試劑盒，其中，在所述Blocker引物的3’末端進行雙脫氧堿基修飾；和/或，在所述Blocker引物的5’末端進行去磷酸化修飾。

3.如權利要求1所述的試劑盒，其中，所述基因突變為EGFR基因19外顯子缺失E746_A750缺失突變，其中，所述Blocker引物的序列為：5’-CAAGGAATTAAGAGAAGCAACATC-3’ddC(SEQ ID NO：9)，上游ARMS引物的序列為：5’-AATTCCCGTCGCTATCAAAAC-3’(SEQ ID NO：10)，下游引物的序列為：5’-ACCCCCACACAGCAAAGC-3’(SEQ ID NO：11)，所述Taqman探針的序列為：5’-CCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAGTTTCTG-3’(SEQ ID NO：12)。