[發明專利]一種基于內質網應激的報告基因細胞株構建方法及其應用

有效

• 申請號: 201710616052.5
• 申請日: 2017-07-25
• 公開（公告）號: CN107189986B
• 公開（公告）日: 2020-08-11
• 發明（設計）人: 吳兵;虞悅;陳慧梅;劉蘇;張徐祥;任洪強
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;C12N15/66;C12Q1/42
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 李倩

1.一種基于內質網應激的報告基因細胞株構建方法，其特征在于：該方法選用與內質網應激相關的CHOP基因作為特異性誘導基因構建CHOP啟動子，再將CHOP啟動子與便于檢測的SEAP基因連接，構建慢病毒CHOP-SEAP質粒載體；最后將CHOP-SEAP質粒轉染至Hela細胞中得到所需的檢測細胞株。

2.根據權利要求1所述的基于內質網應激的報告基因細胞株構建方法，其特征在于，具體包括如下步驟：

步驟1，構建慢病毒CHOP-SEAP質粒載體：將pHBLV-CMVIE-ZsGreen-Puro載體用EcoRI和XhoI酶切，載體酶切完成后進行膠回收；同時根據SEAP基因和CHOP基因序列設計引物并進行PCR擴增，將處理好的目的片段與載體進行連接反應，將連接反應后的片段轉化至DH5a感受態細胞中，轉化后進行平板挑菌，于37℃下250轉/分鐘搖菌14小時，用菌液進行PCR鑒定，得到陽性克隆菌液，將陽性克隆菌液進行測序；

步驟2，慢病毒CHOP-SEAP質粒載體抽提：從步驟1得到的陽性克隆菌液中抽提慢病毒CHOP-SEAP質粒載體，當慢病毒CHOP-SEAP質粒載體濃度大于1 μg/μL，A260/280在1.7~1.8之間時進入下一步的病毒包裝；

步驟3，慢病毒CHOP-SEAP質粒載體包裝：鋪板 293T 細胞用于轉染，操作完畢后置于37℃下、5 % CO₂培養箱中培養，細胞匯合率至70~80 %時進行脂質體轉染，每培養皿100mm的轉染體系為：含有10μg pSPAX2、5μg pMD2G、10μg CHOP-SEAP質粒以及75μL LipofiterTM；轉染后更換含10 %胎牛血清的新鮮完全培養基，轉染后48 h和72 h分別兩次收集病毒上清，將病毒上清于一定條件下離心處理去除細胞碎片；再進行超離心處理，最后將慢病毒超離液分裝到滅菌處理的病毒管中，分裝標記好后于-80℃冰箱保存；

步驟4，穩轉細胞株構建：10cm大培養皿中待細胞長滿后用胰酶消化稀釋至細胞密度為3.0×10⁵ /mL，接種于六孔板，每孔接種體積為2 mL，使得第二天細胞的融合率在60 %左右；感染時采用2 mL 5% FBS的DMEM+1 %雙抗培養液，并加入適量的病毒懸液；感染24 h后，棄去病毒感染液，替換成新鮮完全培養基；病毒感染后待細胞的匯合率達到90%時將細胞轉至10cm的大培養皿中；

步驟5，對穩轉細胞株進行篩選：利用嘌呤霉素多次重復處理病毒感染后的細胞，從中篩選出成功感染病毒的細胞，得到所需的檢測細胞株，隨后對細胞進行擴大培養和凍存。

3.權利要求1或2所述基于內質網應激的報告基因細胞株構建方法構建的報告基因細胞株在表征毒害污染物毒性方面的應用。

4.權利要求1或2所述基于內質網應激的報告基因細胞株構建方法構建的報告基因細胞株在表征實際水體綜合毒性方面的應用。