[發明專利]一種基于內質網應激的報告基因細胞株構建方法及其應用

有效

• 申請號: 201710616052.5
• 申請日: 2017-07-25
• 公開（公告）號: CN107189986B
• 公開（公告）日: 2020-08-11
• 發明（設計）人: 吳兵;虞悅;陳慧梅;劉蘇;張徐祥;任洪強
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;C12N15/66;C12Q1/42
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 李倩

本發明公開了一種基于內質網應激的報告基因細胞株構建方法，該方法選用與內質網應激相關的CHOP基因作為特異性誘導基因構建CHOP啟動子，再將CHOP啟動子與便于檢測的SEAP基因連接，構建慢病毒CHOP?SEAP質粒載體；最后將CHOP?SEAP質粒轉染至Hela細胞中。本發明還公開了上述基于內質網應激的報告基因細胞株構建方法構建的報告基因細胞株的應用。本發明方法構建的報告基因細胞株能夠指示早期細胞毒性損傷，大大提高細胞株的檢測敏感性和降低檢測限值，從而表征毒害污染物的早期毒性，且適用于大多數毒害污染物；同時還可表征實際水體的綜合毒性。細胞株選用的報告基因SEAP基因具有便于檢測、可動態監測的優點。

技術領域

本發明涉及一種基于內質網應激的報告基因細胞株的構建方法，還涉及上述基于內質網應激的報告基因細胞株構建方法構建的報告基因細胞株的應用，屬于污染物毒性細胞檢測領域。

背景技術

據不完全統計，目前世界上已登記的化學物質約400萬種，銷售、生產、使用的化學物質約有5-6萬種，經常使用的約4000多種，而且每年以2萬種的速度增加。它們主要包括：化學藥物、化學試劑、食品添加劑、農藥、裝飾材料、建筑材料、化妝品及軍工產品等。化學品與人們的飲食、工作、生活及周圍環境息息相關，密不可分。同時，化學物對人類健康和生物環境的影響及其危害，也日益受到人們的密切關注。新型的人體細胞毒性試驗相較于傳統毒性試驗而言，可以更直接地體現毒害污染物對于人類健康的影響，但其敏感性仍存在局限性。報告基因法因其敏感、迅速、重現性好的特點，被廣泛應用于毒性評價中。研究表明報告基因法可顯著降低毒性檢出限、提高靈敏度并且縮短響應時間。目前已有的基于報告基因的研究主要是通過特異性的誘導基因和報告基因組合，監測特異性目標物質，例如DNA損傷類物質、內分泌干擾物、二噁英類物質等。但由于污染物毒性效應的復雜性，不同污染物具有不同的毒性效應機制。已有的研究表明內質網應激及損傷是污染物毒性的常見效應之一，因此，構建一株可以指示早期內質網應激及損傷的報告基因細胞株，可以更加靈敏地檢測污染物的早期毒性效應。

水是生命的第一要素，水質優劣與人體健康密切相關。水污染正在嚴重地威脅著人類健康。而現有水質安全性評價方法主要為理化指標檢測(COD、BOD、氨氮、總氮、總磷等)與生物測試(指示生物法、發光菌急性毒性法、大型蚤毒性測試等)相結合。新型的人體細胞毒性試驗相較于傳統毒性試驗而言，可以更直接地體現污染水體對于人類健康的影響，但其敏感性仍存在局限性，目前常用的測定細胞存活率、氧化損傷和遺傳損傷等細胞損傷水平的毒性評估實驗耗時長、操作復雜，且僅能分析環境污染物對細胞或生物體的某一類毒性效應。因此，亟須建立一種操作簡便的毒性評估方法來綜合評價水體的綜合毒性。近年來，基于細胞應激基因啟動子調控的報告基因實驗已成為最具有潛力的毒性評估方法之一，報告基因法因其敏感、迅速、重現性好的特點，被廣泛應用于毒性評價中。研究表明報告基因法可顯著降低毒性檢出限、提高靈敏度并且縮短響應時間。目前已有的基于報告基因的研究主要是通過特異性的誘導基因和報告基因組合，監測特異性目標物質，例如內分泌干擾物受體基因和報告基因組合可用于檢測內分泌干擾物的存在；Gadd153和報告基因組合可以監測環境中的DNA損傷類物質；HSE和報告基因組合可以監測重金屬。但由于實際水體的復雜性，不同污染物具有不同的毒性效應機制，簡單的監測水體中的某幾類特異性目標物質并不能全面表征水體的綜合毒性，且不能指示水體可能造成的早期毒性損傷。因此，構建一株可以指示早期細胞應激及損傷的報告基因細胞株，可以靈敏地檢測污染物的早期毒性效應，并表征水體綜合毒性的檢測細胞株將可以更敏感地評價水質安全。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種基于內質網應激的報告基因細胞株構建方法，該構建方法得到的細胞株不僅可以指示毒害污染物早期的內質網應激效應，表征毒害污染物的毒性效應，而且還可以對水體綜合毒性進行表征。

本發明還要解決的技術問題是提供上述基于內質網應激的報告基因細胞株構建方法構建的報告基因細胞株在表征毒害污染物毒性方面以及在表征實際水體綜合毒性方面的應用。