[發明專利]MTHFR?A1298C基因多態性快速檢測引物、分子信標、試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 201710615435.0
• 申請日: 2017-07-25
• 公開（公告）號: CN107299140A
• 公開（公告）日: 2017-10-27
• 發明（設計）人: 黎幫勇;賀庭禎;向·霄;熊偉
• 申請（專利權）人: 重慶京因生物科技有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 重慶強大凱創專利代理事務所(普通合伙)50217
• 代理人: 成艷

1.MTHFR-A1298C、RS1801131基因多態性快速檢測的試劑盒，其特征在于，包括PCR反應液，PCR反應液的原料及終濃度為，

DNA聚合酶 2.05 U/μL；

dNTPs 0.1-0.5mM；

5X PCR緩沖液 0.5-1.5 X；

MgCl2 1-2.5mM；

十二烷基硫酸鈉 0.0005-0.015％（w/v）；

聚乙二醇辛基苯基醚 0.001-0.03％（w/v）；

上游引物 0.2-0.7μM；

下游引物 0.2-0.7μM；

突變型分子信標 0.2-0.7μM；

野生型分子信標 0.2-0.7μM；

且其用于檢測細胞樣品。

2.根據權利要求2所述的MTHFR-A1298C、RS1801131基因多態性快速檢測的試劑盒，其特征在于：所述的PCR反應液的原料終濃度為：

DNA聚合酶 2.05 U/μL；

dNTPs 0.2mM；

5X PCR緩沖液 1.1X；

MgCl₂ 2.5mM；

十二烷基硫酸鈉 0.005％（w/v）；

聚乙二醇辛基苯基醚 0.01％（w/v）；

上游引物 0.7μM

下游引物 0.7μM；

突變型分子信標 0.7μM；

野生型分子信標 0.6μM。

3.根據權利要求3所述的MTHFR-A1298C、RS1801131基因多態性快速檢測的試劑盒，其特征在于：所述的細胞樣品為口腔黏膜脫落細胞。

4.根據權利要求4所述的MTHFR-A1298C、RS1801131基因多態性快速檢測的試劑盒，其特征在于：還包括有提純的人類基因組DNA基因序列。

5.根據權利要求1~4任意一項所述的試劑盒中的MTHFR-A1298C、RS1801131基因多態性快速檢測的引物，其特征在于，

上游引物5’-3’的基因序列為：CTTCTACCTGAAGAGCAAGTCC；

下游引物5’-3’的基因序列為：CAGCATCACTCACTTTGTGACC。

6.利用與權利要求5所述的試劑盒中引物檢測的MTHFR-A1298C、RS1801131基因多態性快速檢測的分子信標，其特征在于：

野生型分子信標的5’-3’的基因序列為：

CGCCAGTCAAAGA+CA+CTT+T+CTTCACTCTGGCG；

突變型分子信標的5’-3’的基因序列為：

CGCCAGTTCAAAGACACT+T+G+CTTCACCTGGCG；

且野生型分子信標和突變型分子信標基因序列的5’端和3’端分別設有熒光基團和與熒光基團配合的淬滅基團；+為鎖核酸修飾的堿基。

7.根據權利要求6所述的MTHFR-A1298C、RS1801131基因多態性快速檢測的分子信標，其特征在于：所述的熒光基團為6-Fam標記基團，所述的淬滅基團為BHQ1標記基團；

或者熒光基團為Alexa Fluor 594標記基團，所述的淬滅基團為BHQ2標記基團。

8.利用權利要求6或7所述的引物、分子信標和試劑盒進行的MTHFR-A1298C、RS1801131基因多態性快速檢測方法，其特征在于：操作方法為，

（1）取樣前用水漱口2次，每次大于5秒，漱口后吞咽2-3次；

（2）取取樣裝置的取樣部近90°接觸口腔內腮壁，均勻刮拭5次，上、下為1次；

（3）取樣后將取樣裝置的取樣部插入PCR反應液中，混勻；

（4）取1μL提純的DNA基因序列加入到另一支PCR反應液中，混勻；

（5）將完成加樣的PCR反應液放入定量PCR儀中，運行反應程序。

9.利用權利要求8所述的引物、分子信標和試劑盒進行的MTHFR-A1298C、RS1801131基因多態性快速檢測方法，其特征在于：定量PCR儀的反應程序為：

A、預變性：溫度95℃，5min，1個循環；

B、變性：95℃，8s；

C、退火及延伸：55℃，35s；

D、B及C程序操作50個循環。

10.如權利要求9所述的MTHFR-A1298C、RS1801131基因多態性快速檢測方法，其特征在于：所述的定量PCR儀為雙通道，激發波長分別為450-500nm和550-600nm。