[發(fā)明專利]MTHFR?A1298C基因多態(tài)性快速檢測(cè)引物、分子信標(biāo)、試劑盒及檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710615435.0
• 申請(qǐng)日: 2017-07-25
• 公開（公告）號(hào): CN107299140A
• 公開（公告）日: 2017-10-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黎幫勇;賀庭禎;向·霄;熊偉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 重慶京因生物科技有限責(zé)任公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 重慶強(qiáng)大凱創(chuàng)專利代理事務(wù)所(普通合伙)50217
• 代理人: 成艷

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種MTHFR-A1298C、RS1801131基因多態(tài)性快速檢測(cè)的引物、分子信標(biāo)、試劑盒及其檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸(A、T、C、G)的變異所引起的DNA序列的多態(tài)性。與許多疾病相關(guān)，決定著人類疾病的易感性和藥物反應(yīng)的差異性。因此，SNP在分析診斷、臨床檢驗(yàn)、法醫(yī)學(xué)、病原檢測(cè)、遺傳疾病和新藥研發(fā)等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

分子信標(biāo)(molecular beacon)是一種熒光標(biāo)記的寡核苷酸鏈。其在5’和3’末端自身形成一個(gè)8個(gè)堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸分子信標(biāo)，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對(duì)，因此標(biāo)記在一端的熒光基團(tuán)與標(biāo)記在另一端的淬滅基團(tuán)緊緊靠近。根據(jù)Foerster理論，中心熒光能量轉(zhuǎn)移效率與兩者距離的6次方成反比。所以只有熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)之間達(dá)到一定的距離時(shí)才會(huì)產(chǎn)生熒光。自由狀態(tài)時(shí)，分子信標(biāo)呈發(fā)卡式結(jié)構(gòu)，從而熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)相距較近(約7～10nm)。此時(shí)發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，使熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光被淬滅基團(tuán)吸收并以熱的形式散發(fā)，熒光幾乎完全被淬滅，熒光本底極低。當(dāng)分子信標(biāo)與靶分子結(jié)合時(shí)，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)之間的距離加大，從而，分子信標(biāo)的熒光幾乎100％恢復(fù)。而且所檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度與溶液中靶標(biāo)量成正比。分子信標(biāo)具有背景信號(hào)低,靈敏度高、特異識(shí)別性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單，不必與未反應(yīng)的分子信標(biāo)分離即可實(shí)時(shí)檢測(cè)，可用于活體分析等優(yōu)點(diǎn)。在生物化學(xué)分析，生物醫(yī)學(xué)研究和臨床診斷中有著廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

葉酸(folic acid)也叫維生素B9。參與著機(jī)體的很多重要代謝反應(yīng)。葉酸最重要的功能就是制造白血球和紅血球，可增強(qiáng)免疫能力，一旦缺乏葉酸，會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重貧血，因此，葉酸又稱為“造血維生素”。葉酸對(duì)孕婦尤其重要，需求量比正常人高4倍。孕早期是胎兒器官系統(tǒng)分化及胎盤形成的關(guān)鍵時(shí)期，此時(shí)葉酸缺乏可導(dǎo)致胎兒畸形。Shaw和他的同事們?cè)?995 年時(shí)就報(bào)道了婦女在妊娠開始后的1-2個(gè)月之間服用復(fù)合維生素能使子代大大降低心臟流出道畸形的概率。據(jù)報(bào)道，早期孕婦葉酸缺乏的發(fā)生率為19.23％，此發(fā)生率雖然低于歐洲、美國(guó)等國(guó)家(16％-60％)，但高于國(guó)內(nèi)1986年的(9.9％)報(bào)道。研究還發(fā)現(xiàn)人的N5、N10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因編碼是葉酸代謝的關(guān)鍵酶。其功能主要是與胸腺嘧啶合成酶共同作用促成脫氧尿嘧啶核苷酸(dump)接受5-甲基四氫葉酸(5mTHF)提供的甲基轉(zhuǎn)變成脫氧胸腺嘧啶核苷酸(dTMP),進(jìn)而參與到DNA的合成。MTHFR基因位點(diǎn)的突變都會(huì)引起相應(yīng)的酶的活性降低可阻抑同型半胱氨酸轉(zhuǎn)化為甲硫氨酸，會(huì)導(dǎo)致低葉酸血癥。MTHFR(A1298C， rs1801131)有A/A、A/C、C/C三種基因型，其位點(diǎn)是A(腺嘌呤)→C(胞嘧啶)突變，導(dǎo)致其編碼的MTHFR氨基酸序列中第429位點(diǎn)的谷氨酸(Glu)被丙氨酸(Ala)取代，從而影響 MTHFR酶的活性。最終影響代謝酶的活性。

目前針對(duì)SNP的檢測(cè)方法有很多種，根據(jù)是否需要凝膠電泳和自動(dòng)化程度的高低，大致可以分為兩大類，即基于凝膠電泳的SNP檢測(cè)方法和高通量、自動(dòng)化程度較高的SNP檢測(cè)方法。基于凝膠電泳的SNP檢測(cè)方法包括單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)、變性梯度凝膠電泳、酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(CAPS)、等位基因特異性PCR(AS-PCR)。總的來說，這些方法對(duì)設(shè)備要求不高，且投入成本低，但速度慢，結(jié)果有不確定性且很難實(shí)現(xiàn)高通量的SNP檢測(cè)。高通量、自動(dòng)化程度較高的SNP檢測(cè)方法有直接測(cè)序法，該方法費(fèi)用貴且對(duì)雜合體不易分型；基因芯片法，該方法雖然快速高效，但是雜交條件與DNA的GC含量密切相關(guān)，需要找到一種普遍性的雜交條件，同時(shí)需解決重復(fù)序列對(duì)雜交準(zhǔn)確度的影響；芯片造價(jià)昂貴；變性高效液相色譜 (DHPLC),該方法自動(dòng)化程度和檢測(cè)準(zhǔn)確率高，但對(duì)試劑盒環(huán)境的要求較高，不能檢測(cè)出純合突變；高分辨率溶解曲線法，該方法通量高，成本低，結(jié)果準(zhǔn)確但對(duì)設(shè)備的溫度均一性有著嚴(yán)格的要求。且以上方法都需提取DNA才能進(jìn)行檢測(cè)。耗時(shí)長(zhǎng),操作復(fù)雜。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種操作簡(jiǎn)單、成本低且檢測(cè)快速、時(shí)間短的 MTHFR-A1298C、RS1801131基因多態(tài)性快速檢測(cè)所涉及的引物、分子信標(biāo)、試劑盒及其檢測(cè)方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：MTHFR-A1298C、RS1801131基因多態(tài)性快速檢測(cè)的試劑盒，包括PCR反應(yīng)液，PCR反應(yīng)液的原料及終濃度為，