[發明專利]重組EcoRV限制性內切酶的制備方法

在審

• 申請號: 201710614815.2
• 申請日: 2017-07-26
• 公開（公告）號: CN107267544A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發明（設計）人: 李森;雍德祥;鄒剛剛;王方平
• 申請（專利權）人: 通用生物系統（安徽）有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N9/22
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司11212
• 代理人: 沈尚林

技術領域

本發明涉及一種重組EcoR V限制性內切酶的制備方法。

背景技術

限制性核酸內切酶是可以識別特定的核苷酸序列，并在每條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵進行切割的一類酶，簡稱限制酶。根據限制酶的結構，輔因子的需求切位與作用方式，可將限制酶分為三種類型，分別是第一型(Type I)、第二型(Type II)及第三型(Type III)。

第一型限制酶同時具有修飾及識別切割的作用；另有識別DNA上特定堿基序列的能力，通常其切割位距離識別位可達數千個堿基之遠。例如：EcoB、EcoK。

第二型限制酶只具有識別切割的作用，修飾作用由其他酶進行。所識別的位置多為短的回文序列；所剪切的堿基序列通常即為所識別的序列。是遺傳工程上，實用性較高的限制酶種類。例如：BanH I、HindIII。

第三型限制酶與第一型限制酶類似，同時具有修飾及識別切割的作用?？勺R別短的不對稱序列，切割位與識別序列約距24～26個堿基對。例如：Hinf III。

II型限制與修飾系統所占的比例最大，達93％。

其中II型酶相對來說最簡單，它們識別回文對稱序列，在回文序列內部或附近切割DNA，產生帶3′-羥基和5′-磷酸基團的DNA產物，需Mg²⁺的存在才能發揮活性，相應的修飾酶只需SAM。識別序列主要為4～6bp，或更長且呈二重對稱的特殊序列，但有少數酶識別更長的序列或簡并序列，切割位置因酶而異，有些是隔開的。

本發明中的EcoR V限制性內切酶即屬于II型限制酶其識別位點為：

5’-GAT^ATC-3’

5’-CTA^TAG-3’

通過切割T與A之間的磷酸二酯鍵使3’端帶有磷酸基團，5’端帶有羥基。

EcoR V作為一個普通的限制性內切酶，它在生物領域很常見，有關EcoR V蛋白性質特征及功能機制也早有報道。目前商品化EcoR V蛋白的價格較為適中，許多生物公司都有此類產品。通過對本蛋白的研發可以增加在產品方面的競爭力。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種重組EcoR V限制性內切酶的制備方法。

為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是，重組EcoR V限制性內切酶的制備方法，包括以下步驟：

(1)表達質粒pCreat Duet-EcoR V-甲基化酶的構建；

(2)EcoR V與甲基化酶蛋白的誘導表達與鑒定；

(3)EcoR V與甲基化酶蛋白的純化與鑒定。

作為優選，步驟(1)具體包括以下步驟：

(4)EcoR V與甲基化酶的基因合成

根據密碼子優化后的基因序列，直接進行基因合成；

(5)Gibson重組連接

將pCreat Duet通過酶切進行線性化，線性化產物與步驟(4)的基因合成產物進行無縫克隆；

(6)重組產物轉化

將上述重組連接產物20μL轉移到TOP10感受態細胞中，冰上靜置30min，42℃熱激90s，冰上再靜置2min；加入600ul LB液體培養基，37℃搖床200rpm搖45min，涂布于含50ug/mL卡那霉素的LB平板中，37℃培養箱培養過夜；

(7)重組克隆的鑒定

隨機挑取至少4個克隆，接入4mL含卡那霉素LB中；37℃搖床220rpm搖過夜，抽提質粒并測序。

作為優選，步驟(2)具體包括以下步驟：

(8)重組質粒轉化大腸桿菌

將上述鑒定為陽性的重組質粒pCreat Duet-EcoR V-甲基化酶轉入感受態BL21(DE3)中，涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培養過夜；

(9)IPTG誘導蛋白表達

挑單克隆于含卡那霉素LB中，37℃搖床，220rpm培養過夜，以1∶100接過夜菌于4mL含卡那霉素LB板中，繼續培養2.5h，OD600nm達到0.6～0.8時加入IPTG至0.5mM，于15℃過夜誘導蛋白表達；

(10)SDS-PAGE鑒定

取2mL菌液12000rpm離心1min收集菌體，加入100μL的1×上樣緩沖液，煮沸5min，冷卻后12000rpm離心1min，取10μL樣品進行12％聚丙烯酰胺凝膠電泳，取下凝膠利用快染儀染色脫色10min，觀察誘導前后蛋白條帶的變化，結果顯示目的蛋白有表達。

作為優選，步驟(3)具體包括以下步驟：