[發明專利]重組EcoRV限制性內切酶的制備方法

在審

• 申請號: 201710614815.2
• 申請日: 2017-07-26
• 公開（公告）號: CN107267544A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發明（設計）人: 李森;雍德祥;鄒剛剛;王方平
• 申請（專利權）人: 通用生物系統（安徽）有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N9/22
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司11212
• 代理人: 沈尚林

1.重組EcoR V限制性內切酶的制備方法，包括以下步驟：

(1)表達質粒pCreat Duet-EcoR V-甲基化酶的構建；

(2)EcoR V與甲基化酶蛋白的誘導表達與鑒定；

(3)EcoR V與甲基化酶蛋白的純化與鑒定。

2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)具體包括以下步驟：

(4)EcoR V與甲基化酶的基因合成

根據密碼子優化后的基因序列，直接進行基因合成；

(5)Gibson重組連接

將pCreat Duet通過酶切進行線性化，線性化產物與步驟(4)的基因合成產物進行無縫克隆；

(6)重組產物轉化

將上述重組連接產物20μL轉移到TOP10感受態細胞中，冰上靜置30min，42℃熱激90s，冰上再靜置2min；加入600ul LB液體培養基，37℃搖床200rpm搖45min，涂布于含50ug/mL卡那霉素的LB平板中，37℃培養箱培養過夜；

(7)重組克隆的鑒定

隨機挑取至少4個單克隆，接入4mL含卡那霉素LB中；37℃搖床220rpm搖過夜，抽提質粒并測序。

3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)具體包括以下步驟：

(8)重組質粒轉化大腸桿菌

將上述鑒定為陽性的重組質粒pCreat Duet-EcoR V-甲基化酶轉入感受態BL21(DE3)中，涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培養過夜；

(9)IPTG誘導蛋白表達

挑單克隆于含卡那霉素LB中，37℃搖床，220rpm培養過夜，以1∶100接過夜菌于4mL含卡那霉素LB板中，繼續培養2.5h，OD600nm達到0.6～0.8時加入IPTG至0.5mM，于15℃過夜誘導蛋白表達；

(10)SDS-PAGE鑒定

取2mL菌液12000rpm離心1min收集菌體，加入100μL的1×上樣緩沖液，煮沸5min，冷卻后12000rpm離心1min，取10μL樣品進行12％聚丙烯酰胺凝膠電泳，取下凝膠利用快染儀染色脫色10min，觀察誘導前后蛋白條帶的變化，結果顯示目的蛋白有表達。

4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)具體包括以下步驟：

(11)EcoR V-甲基化酶蛋白的誘導表達

將過夜培養已轉入pCreat Duet-EcoR V-甲基化酶的BL21(DE3)菌液以1∶100接于800ml含卡那霉素LB中，37℃搖床，220rpm培養2h，OD600nm達到0.6-0.8時，加入IPTG至0.5mM，于15℃過夜誘導蛋白表達，8000rpm離心10min，收集菌體，-20℃保存；

(12)細菌蛋白表達形式的分析

-20℃凍存菌體按每克濕菌5mL的比例加入細菌裂解液，超聲破菌，4℃，16000rpm離心15min，沉淀在底部，分別取上清、包涵體做SDS-PAGE，結果顯示EcoR V蛋白一部分存在于上清中；

(13)EcoR V蛋白的純化

收集菌體加入裂解液重懸，超聲破碎后離心，16000rpm離心15min，將上清液置于50ml的離心管中加入2ml Ni柱，4℃孵育2h，裂解液洗柱100ml；利用含有20mM咪唑的裂解液洗脫30ml，含有500mM咪唑的裂解液洗脫5ml；以EcoR V儲存液作為流動相過分子篩Superdex 200，根據紫外吸收值收集含目的蛋白的洗脫液，將目的蛋白液用12％的SDS-PAGE進行檢測。