[發明專利]一種家蠶肽聚糖識別蛋白的表達和純化方法

在審

• 申請號: 201710614785.5
• 申請日: 2017-07-26
• 公開（公告）號: CN107236030A
• 公開（公告）日: 2017-10-10
• 發明（設計）人: 王強;任美佳;鞠小麗
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C07K1/22;C12N15/70;C12N15/12
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技術領域

本發明屬于昆蟲免疫領域，特別涉及一種家蠶肽聚糖識別蛋白（PGRP-S1）的原核表達。

背景技術

家蠶是一種重要的經濟昆蟲，蠶絲用來制作絲綢，銷售于海內外，帶動了相關企業的發展，極大的促進了我國的經濟發展。蠶蛹中含有豐富的蛋白質，可食用。蠶沙和蠶蛻的皮可入藥，具有重要的藥用價值。所以為了提高家蠶成活率，增強家蠶對病原微生物的抵御能力，研究家蠶免疫是必不可少的。而且關于蠶對微生物病原體免疫的文獻已經有越來越多被報道。

家蠶屬于鱗翅目昆蟲，既是重要的經濟昆蟲，又是重要的模式生物。家蠶缺乏后天免疫，在與微生物的長期進化過程中形成了一套比較完善的免疫機制即先天免疫，用來抵御病原微生物的入侵。家蠶先天免疫主要依靠模式識別受體識別病原體相關分子模式進而激活先天免疫通路，從而殺死微生物。這些病原體相關分子模式只存在病原微生物而不存在宿主中，如脂多糖、肽聚糖等，這些病原體相關分子模式被相應的模式識別受體識別，從而激活下游的信號通路。肽聚糖識別蛋白（PGRP）家族是家蠶最重要的模式識別受體，它可以識別病原微生物的肽聚糖，進而觸發家蠶的免疫通路，從而激活或抑制抗菌肽的表達。有研究表明，家蠶感染革蘭氏陰性菌激活Imd通路得到免疫應答，革蘭氏陽性菌激活Imd通路得到免疫應答，但也有證據報道表明這兩種途徑之間相互聯系。

家蠶的基因組中已鑒定出12個肽聚糖識別蛋白基因，這些肽聚糖識別蛋白具有一個PGRP結構域，用來結合病原微生物的肽聚糖，進而啟動或抑制抗菌肽的合成。已有證據表明一些肽聚糖識別蛋白也可以觸發酚氧化酶通路的激活，促進黑化作用。一些肽聚糖識別蛋白也可以直接作為殺菌劑殺死細菌。

發明內容

本發明提供了一種家蠶肽聚糖識別蛋白S1的原核表達載體的構建。

本發明是通過下列技術方案實現的：

家蠶肽聚糖識別蛋白S1原核表達的方法，從家蠶脂肪體組織中提取總RNA，通過逆轉錄合成cDNA，以此為模板，通過設計引物從家蠶脂肪體組織中擴增得到家蠶肽聚糖識別蛋白S1基因。

家蠶肽聚糖識別蛋白S1原核表達的方法，

設計引物的上游引物是 5'- CGCAGGATCCGACATGGCCCGCCTCC -3'（BamH1）, （SEQ ID NO.1）；

下游引物是5'- ATTAGCGGCCGCTCTTGATGGAGTCCACGTTCT -3'(Not1) （SEQ ID NO.2）。 設計的引物中插入酶切位點，以便于用分子克隆的方法將家蠶肽聚糖識別蛋白S1基因克隆到原核表達載體PET-30a中，將構建好的原核表達載體轉化DH5α，將菌液PCR和酶切驗證的陽性克隆測序，將測序正確的陽性克隆提取質粒轉化BL21（DE3）。

家蠶肽聚糖識別蛋白S1原核表達的方法，將測序正確的BL21（DE3）過夜培養，然后以1:100用新鮮培養基稀釋，繼續培養至OD值大約在0.5左右，加入終濃度為0.8mM的IPTG和質量濃度為20%的葡萄糖誘導，誘導時間為5h。由于表達的蛋白帶有His標簽，可以用鎳離子螯合磁珠進行純化。

鎳離子螯合磁珠進行純化包涵體蛋白的方法，按照下述步驟進行：

（1）將誘導的菌液離心，收集沉淀，將沉淀用1×PBS洗滌兩次，離心棄上清，沉淀加入適量的1×PBS并懸浮，冰上超聲（功率：25%，運行3秒、間歇8秒，25 次）裂解，離心，分別取上清和沉淀進行12%SDS-PAGE，以確定目的蛋白的可溶性。

（2）樣品處理：沉淀用適量的包涵體洗滌液（1M鹽酸胍、20mM磷酸鈉、500mMNaCl,PH=7.8）重懸，離心棄上清。沉淀用適量的包涵體裂解液（6M鹽酸胍、20mM磷酸鈉、500mMNaCl,PH=7.8）重懸，離心得到上清。

（3）磁珠預處理：用Buffer A（8M尿素、20mM磷酸鈉、500mMNaCl,PH=7.8）平衡鎳離子螯合磁珠磁珠與目的蛋白結合：磁珠中加入樣品處理步驟中離心得到的上清液，使目的蛋白與磁珠結合。

（4）磁珠洗滌：用Buffer B（8M尿素、20mM磷酸鈉、500mMNaCl,PH=6.0）和Buffer C（8M尿素、20mM磷酸鈉、500mMNaCl,PH=5.3）對磁珠進行洗滌，以除去雜蛋白。

（5）目的蛋白洗脫：用BufferD（8M尿素、20mM磷酸鈉、500mMNaCl,PH=4.0）洗脫目的蛋白。

（6）目的蛋白復性：采用透析法對包涵體進行復性。