[發明專利]一種家蠶肽聚糖識別蛋白的表達和純化方法

在審

• 申請號: 201710614785.5
• 申請日: 2017-07-26
• 公開（公告）號: CN107236030A
• 公開（公告）日: 2017-10-10
• 發明（設計）人: 王強;任美佳;鞠小麗
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C07K1/22;C12N15/70;C12N15/12
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.家蠶肽聚糖識別蛋白S1原核表達的方法，其特征在于：

設計引物的上游引物是 5'- CGCAGGATCCGACATGGCCCGCCTCC -3',

下游引物是5'- ATTAGCGGCCGCTCTTGATGGAGTCCACGTTCT -3；

設計的引物中插入酶切位點，以便于用分子克隆的方法將家蠶肽聚糖識別蛋白S1基因克隆到原核表達載體PET-30a中，將構建好的原核表達載體轉化DH5α，將菌液PCR和酶切驗證的陽性克隆測序，將測序正確的陽性克隆提取質粒轉化BL21（DE3）。

2.家蠶肽聚糖識別蛋白S1原核表達的方法，其特征在于將測序正確的BL21（DE3）過夜培養，然后取40μL菌液加入4mL新培養液，繼續培養至OD值大約在0.5左右，加入終濃度為0.8mM的異丙基硫代半乳糖苷（簡稱IPTG）和質量濃度為20%的葡萄糖誘導，誘導時間為5h；由于表達的蛋白帶有His標簽，可以用鎳離子螯合磁珠進行純化。

3.鎳離子螯合磁珠進行純化包涵體蛋白的方法，其特征在于按照下述步驟進行：

（1）將誘導的菌液離心，收集沉淀，將沉淀用1×PBS洗滌兩次，離心棄上清，沉淀加入適量的1×PBS并懸浮，冰上超聲（功率：25%，運行3秒、間歇8秒，25 次）裂解，離心，分別取上清和沉淀進行12%SDS-PAGE，以確定目的蛋白的可溶性；

（2）樣品處理：沉淀用適量的包涵體洗滌液（1M鹽酸胍、20mM磷酸鈉、500mMNaCl,PH=7.8）重懸，離心棄上清；

沉淀用適量的包涵體裂解液（6M鹽酸胍、20mM磷酸鈉、500mMNaCl,PH=7.8）重懸，離心得到上清；

（3）磁珠預處理：用Buffer A（8M尿素、20mM磷酸鈉、500mMNaCl,PH=7.8）平衡鎳離子螯合磁珠磁珠與目的蛋白結合：磁珠中加入樣品處理步驟中離心得到的上清液，使目的蛋白與磁珠結合；

（4）磁珠洗滌：用Buffer B（8M尿素、20mM磷酸鈉、500mMNaCl,PH=6.0）和Buffer C（8M尿素、20mM磷酸鈉、500mMNaCl,PH=5.3）對磁珠進行洗滌，以除去雜蛋白；

（5）目的蛋白洗脫：用BufferD（8M尿素、20mM磷酸鈉、500mMNaCl,PH=4.0）洗脫目的蛋白；

（6）目的蛋白復性：采用透析法對包涵體進行復性。