[發(fā)明專利]適用于MALDI?TOF檢測的微生物培養(yǎng)液處理方法及快速鑒定方法

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• 申請日: 2017-07-24
• 公開（公告）號: CN107219110A
• 公開（公告）日: 2017-09-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李濤;劉飛;蒲曉允;張立群;蔣棟能;項貴明;黃微微
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28;G01N27/62
• 代理公司: 北京同恒源知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11275
• 代理人: 趙榮之

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物檢測領(lǐng)域，涉及適用于MALDI-TOF檢測的微生物培養(yǎng)液處理方法，還涉及血培養(yǎng)陽性瓶中微生物的快速鑒定方法。

背景技術(shù)

血流感染是一種嚴(yán)重的全身感染性疾病，病院微生物在循環(huán)血液中呈一過性、間接性或持續(xù)存在，對機(jī)體所有臟器，特別是心臟瓣膜、關(guān)節(jié)等造成損害，嚴(yán)重者可導(dǎo)致休克、多器官衰竭、彌散性血管內(nèi)凝血，甚至死亡。目前血培養(yǎng)是診斷血流感染的金標(biāo)準(zhǔn)。血培養(yǎng)是把新鮮離體的血液標(biāo)本接種到一個或多個培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)管中，在一定溫度和濕度等條件下，使對營養(yǎng)要求較高的細(xì)菌或真菌生長繁殖并對其進(jìn)行鑒別，從而確定病原微生物的一種人工培養(yǎng)法。可用來發(fā)現(xiàn)和識別可培養(yǎng)分離的微生物，如腸桿菌科、葡萄菌屬、念珠菌屬等。如何快速檢測出血流感染患者血液中的病原微生物對感染性疾病的診斷、治療和預(yù)后有重要的臨床意義。

在我國絕大部分二級以上醫(yī)院都已使用全自動血培養(yǎng)系統(tǒng)，主要有法國梅里埃的Bact_Alert 3D、美國BD的Bactec FX和美國賽默飛的VersaTREK等型號，用于接種血液標(biāo)本的培養(yǎng)容器統(tǒng)稱為血培養(yǎng)瓶，接種過血液的血培養(yǎng)瓶，可通過培養(yǎng)儀自動監(jiān)測其中的微生物生長情況，對有微生物生長的血培養(yǎng)瓶，儀器自動報陽，隨后工作人員再對陽性瓶進(jìn)行處理。傳統(tǒng)的血培養(yǎng)陽性瓶中微生物鑒定流程主要為：血培養(yǎng)儀報陽后，轉(zhuǎn)鐘適宜平皿，培養(yǎng)直到長出可見菌落，再對其進(jìn)行鑒定。流程中根據(jù)微生物種類的不同，培養(yǎng)時間存在較大差異，如腸桿菌科18到24小時可見明顯菌落，而對于一些厭氧菌則需要兩到三天甚至更久，對于血流感染患者來說時間就是生命，因此血培養(yǎng)陽性瓶中微生物的快速鑒定對于臨床非常重要。

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀近幾年來在我國臨床微生物檢測方面廣泛使用，該儀器主要由兩部分組成：基質(zhì)輔助激光解吸電離離子源(MALDI)和飛行時間質(zhì)量分析器(TOF)。MALDI的原理是用激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過程中將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到生物分子或從生物分子得到質(zhì)子，而使生物分子電離的過程。因此它是一種軟電離技術(shù)，適用于混合物及生物大分子的測定。TOF的原理是離子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據(jù)到達(dá)檢測器的飛行時間不同而被檢測即測定離子的質(zhì)荷比(M/Z)與離子的飛行時間成正比，從而檢測離子的分子量。分子量是有機(jī)化合物最基本的理化性質(zhì)參數(shù)，MALDI-TOF可直接應(yīng)用于混合物的分析，也可用來檢測樣品中是否含有雜質(zhì)及雜質(zhì)的分子量，如多肽、蛋白質(zhì)等。其主要優(yōu)點有檢測速度快、靈敏度高、準(zhǔn)確度高及分辨率高等特點，目前在我國絕大部分臨床微生物室主要用于微生物的快速鑒定。

現(xiàn)階段，細(xì)菌耐藥已成為全球的公共衛(wèi)生安全問題，在我國已上升到國家高度，國家衛(wèi)計委連續(xù)幾年下發(fā)了抗生素合理使用的相關(guān)文件。血液標(biāo)本是細(xì)菌耐藥監(jiān)測最重要的細(xì)菌來源之一，因此做好存在血流感染患者抗生素的合理使用顯得尤為重要。血流感染患者一般病情較重，傳統(tǒng)的血培養(yǎng)陽性瓶中微生物的鑒定流程時間較長，往往醫(yī)生需要在鑒定結(jié)果出來之前給予病人經(jīng)驗用藥，這樣錯誤用藥的概率較高。因此急需一種微生物的快速鑒定方法，可在較短時間內(nèi)確定微生物種類，結(jié)合耐藥監(jiān)測數(shù)據(jù)，可有效降低經(jīng)驗用藥錯誤的風(fēng)險，減少抗生素的濫用。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種適用于MALDI-TOF檢測的血培養(yǎng)陽性菌懸液處理方法；本發(fā)明的目的之二在于提供基于MALDI-TOF快速鑒定血培養(yǎng)陽性瓶中微生物的方法。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

1、適用于MALDI-TOF檢測的血培養(yǎng)陽性菌懸液處理方法，包括如下步驟：將血培養(yǎng)陽性菌懸液加入冰醋酸裂解紅細(xì)胞，離心去除上清，沉淀加入體積分?jǐn)?shù)10％的冰醋酸溶液裂解紅細(xì)胞，混勻后再次離心，去上清，沉淀即為待測物。

本發(fā)明中，優(yōu)選為將血培養(yǎng)陽性菌懸液加入相當(dāng)于菌懸液體積0.2倍的冰醋酸裂解紅細(xì)胞，在12000g條件下離心2min，去上清，再向沉淀中加入體積分?jǐn)?shù)10％的冰醋酸溶液，混勻，再次12000g離心2min，去上清，沉淀即為待測物。

2、基于MALDI-TOF快速鑒定血培養(yǎng)陽性瓶中微生物的方法，

(1)將血培養(yǎng)標(biāo)本收到血培養(yǎng)瓶后放入全自動血培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行檢測，儀器報陽性后，取出陽性血培養(yǎng)瓶，無菌條件下從培養(yǎng)瓶中取出培養(yǎng)液，制成菌懸液；

(2)將步驟(1)制成的菌懸液按照權(quán)利要求1或2所述的方法處理，制得待測物；