[發(fā)明專利]一種特立帕肽的制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710607171.4
• 申請日: 2017-07-24
• 公開（公告）號: CN109096388A
• 公開（公告）日: 2018-12-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王衛(wèi)國;章方良;劉承
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇金斯瑞生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/635
• 分類號: C07K14/635;C07K1/06;C07K1/04
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 32218
• 代理人: 傅婷婷;夏平

本發(fā)明公開了一種特立帕肽的制備方法，包括以下步驟：(1)采用樹脂為固相載體，與特立帕肽C端氨基酸酯化，制備氨基酸?樹脂復(fù)合物；(2)采用Fmoc策略固相多肽合成方法，制備保護(hù)的特立帕肽?樹脂復(fù)合物；(3)采用切割試劑脫除側(cè)鏈保護(hù)基并將特立帕肽從樹脂上裂解下來，乙醚沉淀后得到特立帕肽粗品；(4)采用高效液相法純化粗品，得到特立帕肽精品。本發(fā)明適合簡便、高效制備特立帕肽。本發(fā)明解決了現(xiàn)有方法復(fù)雜、副反應(yīng)多的問題。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬多肽化學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種特立帕肽的制備方法。

背景技術(shù)

特立帕肽序列為SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF，是一條含34個氨基酸的多肽。特立帕肽由美國禮來公司開發(fā)，美國食品藥品監(jiān)督管理局于2002年11月26日批準(zhǔn)了特立帕肽用于治療男人和絕經(jīng)期婦女的具有高度骨折風(fēng)險的骨質(zhì)疏松癥，也用于治療男人的原發(fā)和或由于性機(jī)能減退造成的具有高骨折風(fēng)險的骨質(zhì)疏松。目前的常規(guī)骨質(zhì)疏松藥物一般只是作用于破骨細(xì)胞而減緩或阻斷骨質(zhì)流失，而特立帕肽這種甲狀旁腺激素的衍生物有增加成骨細(xì)胞數(shù)目、增強(qiáng)其活性及阻止成骨細(xì)胞凋亡的作用。因其可增加成骨細(xì)胞的活性及數(shù)量，從而可以促進(jìn)骨生長，用于嚴(yán)重骨質(zhì)疏松的二線治療。此外特立帕肽副作用很小，通常只是惡心、眩暈和腿痛性痙攣。因此特立帕肽具有很高的藥用價值和廣闊的市場前景。

特立帕肽的制備主要采用化學(xué)法合成。據(jù)《合成化學(xué)》雜志2007，15(3)：388-390的報道，采用王樹脂，以DCC/HOBT為縮合劑，色氨酸用Fmoc-Trp-OH，合成了特立帕肽。此方法中DCC縮合過程中容易產(chǎn)生DCU沉淀，后處理麻煩；氨基酸與王樹脂連接時容易發(fā)生消旋；色氨酸的側(cè)鏈不保護(hù)，在縮合及切割過程中都會發(fā)生副反應(yīng)，最終的產(chǎn)率只有23.3％。專利CN201210213044.3采用5個多肽片段縮合法合成特立帕肽，工藝復(fù)雜，縮合效率低。專利CN201310403743.9采用酯鍵替代酰胺鍵的方法合成特立帕肽，該方法中形成酯鍵的反應(yīng)效率較低，且酯鍵不穩(wěn)定，在重復(fù)的Fmoc脫保護(hù)反應(yīng)中易斷裂。專利CN201410262511.0采用偽脯二肽，大大增加了合成成本，并提高了工藝復(fù)雜性。專利CN201511024053.8采用縮合多個二肽或三肽片段的方式合成特立帕肽，增加了工藝復(fù)雜性。專利CN201510005427.5以王樹脂或氯樹脂為載體，DIC/HOBT為縮合劑合成特立帕肽；其中His、Arg、Asn和Trp側(cè)鏈活性基團(tuán)沒有被保護(hù)，在合成及切割反應(yīng)中容易發(fā)生副反應(yīng)，且所用的切割試劑無法避免Met(O)雜質(zhì)的產(chǎn)生。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種簡便、高效的特立帕肽制備方法，解決目前特立帕肽制備繁瑣、合成及切割時發(fā)生副反應(yīng)的問題。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種特立帕肽的制備方法，包括以下步驟：

(1)制備Fmoc-Phe-樹脂復(fù)合物：用N,N-二甲基甲酰胺溶解特立帕肽C端第一個氨基酸Fmoc-Phe-OH及酯化試劑后，加入到用N,N-二甲基甲酰胺浸泡處理后的樹脂中進(jìn)行酯化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，加入樹脂體積10倍的甲醇/N,N-二異丙基乙胺混合溶液(體積比為1：1)，室溫反應(yīng)1h后過濾。然后用N,N-二甲基甲酰胺洗滌樹脂，得到Fmoc-Phe-樹脂復(fù)合物；

(2)制備保護(hù)的特立帕肽-樹脂復(fù)合物：向步驟(1)得到的Fmoc-Phe-樹脂復(fù)合物中加入Fmoc脫保護(hù)試劑脫除Fmoc保護(hù)基，反應(yīng)結(jié)束后過濾并用二甲基甲酰胺洗滌樹脂，然后向Phe-樹脂復(fù)合物中加入特立帕肽的C端第二個氨基酸和縮合試劑進(jìn)行縮合反應(yīng)，縮合反應(yīng)結(jié)束后用二甲基甲酰胺洗滌樹脂；按照特立帕肽從C端到N端的順序，更換氨基酸，重復(fù)Fmoc脫保護(hù)反應(yīng)和縮合反應(yīng)，得到保護(hù)的特立帕肽-樹脂復(fù)合物；

(3)制備特立帕肽粗品：向保護(hù)的特立帕肽-樹脂復(fù)合物中加入切割試劑，脫除多肽側(cè)鏈保護(hù)基并將特立帕肽從樹脂上裂解下來，乙醚沉淀后得到特立帕肽粗品；