[發明專利]一種特立帕肽的制備方法

在審

• 申請號: 201710607171.4
• 申請日: 2017-07-24
• 公開（公告）號: CN109096388A
• 公開（公告）日: 2018-12-28
• 發明（設計）人: 王衛國;章方良;劉承
• 申請（專利權）人: 江蘇金斯瑞生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/635
• 分類號: C07K14/635;C07K1/06;C07K1/04
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 傅婷婷;夏平

1.一種特立帕肽的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)制備Fmoc-Phe-樹脂復合物：用N,N-二甲基甲酰胺溶解特立帕肽C端第一個氨基酸Fmoc-Phe-OH及酯化試劑后，加入到用N,N-二甲基甲酰胺浸泡處理后的樹脂中進行酯化反應，反應結束后，加入甲醇/N,N-二異丙基乙胺混合液(體積比為1：1)反應1h后過濾，然后用N,N-二甲基甲酰胺洗滌樹脂，得到Fmoc-Phe-樹脂復合物；

(2)制備保護的特立帕肽-樹脂復合物：向步驟(1)得到的Fmoc-Phe-樹脂復合物中加入Fmoc脫保護試劑脫除Fmoc保護基，反應結束后過濾并用N,N-二甲基甲酰胺洗滌樹脂得到Phe-樹脂復合物，然后向Phe-樹脂復合物中加入特立帕肽的C端第二個氨基酸和縮合試劑進行縮合反應，縮合反應結束后用二甲基甲酰胺洗滌樹脂；按照特立帕肽從C端到N端的順序，更換氨基酸，重復Fmoc脫保護反應和縮合反應，得到保護的特立帕肽-樹脂復合物；

(3)制備特立帕肽粗品：向保護的特立帕肽-樹脂復合物中加入切割試劑，脫除多肽側鏈保護基并將特立帕肽從樹脂上裂解下來，乙醚沉淀后得到特立帕肽粗品；

(4)制備特立帕肽精品：采用反相高效液相色譜分離純化特立帕肽粗品，得到特立帕肽精品。

2.根據權利要求1所述的特立帕肽的制備方法，其特征在于，步驟(1)中所述的樹脂為王樹脂或2-氯樹脂；優選2-氯三苯甲基氯樹脂。

3.根據權利要求1所述的特立帕肽的制備方法，其特征在于，步驟(1)中所述的酯化試劑為N,N-二異丙基乙胺，所述的各物質間的物質的量的比例為n(Fmoc-Phe-OH)：n(N,N-二異丙基乙胺)：n(2-氯三苯甲基氯樹脂)＝3～0.1：60～2：1；所述酯化反應的溫度為20℃～60℃，反應時間為1小時～10小時。

4.根據權利要求1所述的特立帕肽的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述的Fmoc脫保護試劑是體積比為1：1～4的哌啶與二甲基甲酰胺的混合物，所述Fmoc脫保護反應的溫度為20℃～60℃，反應時間為10min～60min。

5.根據權利要求1所述的特立帕肽的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述的氨基酸的保護基分別為：所有氨基酸的α氨基均為Fmoc保護基，絲氨酸側鏈羥基保護基為叔丁基，天冬氨酸和谷氨酸側鏈羧基保護基為叔丁基，谷氨酰胺和天冬酰胺側鏈保護基為三苯甲基，組氨酸側鏈保護基為三苯甲基或叔丁氧羰基，賴氨酸和色氨酸側鏈保護基為叔丁氧羰基，精氨酸側鏈保護基為2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰基。

6.根據權利要求1所述的特立帕肽的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述的縮合試劑為縮合試劑1、縮合試劑2及縮合試劑3的組合，縮合試劑1選自N,N-二環己基碳二亞胺、N,N-二異丙基碳二亞胺、苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯、卡特縮合劑、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷中的一種，縮合試劑2選自1-羥基苯并三氮唑、N-羥基-7-偶氮苯并三氮唑中的一種；縮合試劑3選自N,N-二異丙基乙胺；且N,N-二環己基碳二亞胺或N,N-二異丙基碳二亞胺不與二異丙基乙胺組合應用。

7.根據權利要求1所述的特立帕肽的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述的各試劑的物質的量的比例為：氨基酸：縮合試劑1：縮合試劑2：縮合試劑3：樹脂＝6～3：6～3：6～3：12～6：1；所述縮合反應的溫度為20℃～60℃，反應時間為1小時～4小時。

8.根據權利要求1所述的特立帕肽的制備方法，其特征在于，步驟(3)中所述的切割試劑為重蒸水、三乙基硅烷、1,2二硫蘇糖醇、苯酚、苯甲硫醚、碘化銨、三異丙基硅烷、苯甲醚和乙二硫醇中的至少一種與三氟乙酸的混合液，所述的混合液中三氟乙酸的體積比不小于80％；向保護的特立帕肽-樹脂復合物中加入切割試劑進行反應的溫度為0℃～60℃，反應時間為1小時～4小時。

9.根據權利要求1所述的特立帕肽的制備方法，其特征在于，步驟(4)中所述的純化條件為：制備柱填料為碳載硅膠類型，流動相為質量比為0.1％TFA的水、乙腈或甲醇溶液。