[發明專利]基于轉座酶建立過表達穩定系的質粒載體及其應用

在審

• 申請號: 201710606285.7
• 申請日: 2017-07-24
• 公開（公告）號: CN107400679A
• 公開（公告）日: 2017-11-28
• 發明（設計）人: 尹東;胡開順;陳恒星;李瑜
• 申請（專利權）人: 中山大學孫逸仙紀念醫院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/62;C12N5/10
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司44245
• 代理人: 崔紅麗,裘暉

技術領域

本發明屬于基因工程領域，具體的說，本發明涉及到運用Gateway克隆技術構建質粒載體，該一系列質粒載體帶有不同的標簽序列和篩選基因GFP，通過轉座子系統將目的基因整合到細胞基因組，實現基因的轉移。特別涉及一種基于轉座酶建立過表達穩定系的質粒載體及其應用

背景技術

過表達穩定細胞株是指外源DNA整合到宿主細胞基因組中，可使宿主細胞長期表達目的基因，與瞬轉株相比，穩定細胞株能夠很大程度上的方便實驗研究和降低實驗成本。因此，構建基因過表達穩定株在基因功能與機制的研究中被廣泛應用。目前構建穩定細胞株主要是通過病毒包裝、感染目的細胞的方式來實現的，這種方法耗時長，通常需要兩個星期左右。此外，由于所插入的目的基因片段大小受到病毒質粒自身大小的限制，通常目的基因片段大小不能超過3Kb，并且操作人員有感染病毒的潛在安全隱患。與此同時，過表達質粒載體通常采用插入到多克隆位點的方法構建，這種方法不僅效率較低，并且消耗時間長，極大地影響了科研人員的實驗進程。

轉座子(Transposon)最早是由McClintock于20世紀50年代在研究玉米籽粒的顏色變異中發現的一類不依靠同源重組而能在基因組內和基因組間發生位置改變的DNA序列，因此也被稱為跳躍基因或者可移動元件。DNA轉座子是其中一種轉座機制類型，目前使用較為廣泛的DNA轉座子類型是Sleeping Beauty轉座子。首個有活性的Sleeping Beauty轉座子是通過對魚類基因組中多個失活的Tc1/mariner轉座子進行分子重建產生的，該轉座子能夠插入到AT二堿基區域，并具有插入至內含子中的傾向。此后，為了進一步提高Sleeping Beauty的轉座活性，研究人員通過對Sleeping Beauty轉座酶基因氨基酸突變的方法對其酶活性進行了廣泛的篩選，最終獲得了活性增加100倍的Sleeping Beauty突變體(SB100X))。經過改良后的Sleeping Beauty轉座子采用“剪切-粘貼”的轉座機制，具體的說是：在細胞中，轉座酶SB100X識別Sleeping Beauty轉座子兩端特異的反向重復序列(ITRS)，并將轉座子序列切出，然后通過DNA攻擊的方式插入新的基因組位置。這種Sleeping Beauty轉座子的優點是：構建穩定株不需要包裝病毒，大大的縮短了穩定株構建的時間，避免了包裝病毒過程中所產生的生物安全問題；同時插入的目的片段大小不受限制；穩定重組效率高。

Gateway克隆技術是由Invitrogen公司開發的一項基因克隆新技術，該技術利用位點特異性重組反應：BP反應和LR反應，并利用大腸桿菌自殺基因ccdB，極大地提高了克隆的效率，同時大大的縮短了構建質粒的時間。

發明內容

為了克服現有技術的不足，本發明的首要目的在于提供一系列基于轉座酶快速建立過表達穩定系的質粒載體。

本發明的另一目的在于滿足常規的在真核細胞中表達目的基因的需要，本發明提供的一系列質粒載體中帶有Flag、HA、V5或Myc標簽序列，這些標簽序列的存在使目的基因的Western、免疫熒光、ELISA等的檢測通過Flag、HA、V5或Myc抗體即可進行，節省了購買抗體或自行制備抗體的費用和時間，對于進行IP或co-IP也帶來了很大的便利。同時本發明提供的一系列質粒載體分為帶有篩選基因GFP和不帶篩選基因GFP兩類，方便流式實驗篩選出陽性細胞，同時也可以驗證質粒轉染的效率。

該質粒載體包括Sleeping Beauty轉座子元件(ITRS)，強啟動子CAG驅動的ccdB基因元件，ccdB基因元件兩側分別含有重組位點attR1和attR2，在重組位點attR1的上游帶有不同標簽序列。同時該系列質粒載體分為帶有篩選基因GFP和不帶篩選基因GFP兩類。通過Gateway LR反應生成含帶有Sleeping Beauty轉座子作用元件(ITRS)，不同標簽序列和篩選基因GFP的質粒載體。同時采用該系統能夠很好地將目的基因整合到受體基因組中，實現基因的轉移。

本發明提供以pSM1.1-HA-Puro-GFP為基礎，構建用于基因功能與機制研究的一系列質粒載體。本方法融合了轉座子和Gateway克隆技術的優點，可簡單高效地用于構建過表達穩定株。

本發明的另一目的在于提供上述質粒載體的應用。

本發明的目的通過下述技術方案實現：