[發明專利]一種用于高效純化相互作用蛋白的克隆載體

在審

• 申請號: 201710606252.2
• 申請日: 2017-07-24
• 公開（公告）號: CN107400678A
• 公開（公告）日: 2017-11-28
• 發明（設計）人: 尹東;胡開順;李瑜;嚴海燕
• 申請（專利權）人: 中山大學孫逸仙紀念醫院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/62
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司44245
• 代理人: 崔紅麗,裘暉

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，涉及一種用于高效純化相互作用蛋白的克隆載體，具體涉及一種基于轉座酶建立過表達穩定系的質粒載體及其在鑒定相互作用蛋白研究中的應用。

背景技術

在基因組學時代，基因功能分析是其重要的遺傳學分支。在細胞或動物水平上，利用過表達載體人為上調目的基因的表達是研究基因功能的重要手段之一。目前根據基因在細胞過表達的時效性可以將細胞分為瞬轉株或穩轉株。穩轉株是將外源基因整合到細胞自身的基因組上，隨著細胞的生長分裂外源基因可以穩定表達，同時經過抗生素加壓篩選，最終得到能夠穩定表達蛋白的細胞株。相比瞬轉株而言，穩轉株在很大程度上方便實驗研究和降低頻繁轉染的成本。當前常用的穩定系構建的方法主要有兩種，一種是基于病毒整合的原理，該種方法需要人工制備病毒，因而操作繁瑣，且存在安全隱患；另一種是基于非同源重組隨機整合，由于其整合效率非常低，導致篩選周期長，外源片段表達效率低，因而逐漸被淘汰。近年來，一種稱為“睡美人”的轉座系統逐漸進入研究人員的視野，該系統采用“剪切粘貼”的轉座機制，由轉座酶識別靶目標序列兩端特異的反向重復序列(ITRS)，將靶目標序列整合至宿主基因組DNA中。使用轉座技術構建基因過表達穩定株具有操作簡單、試驗周期短、效率高等明顯優勢。

在蛋白相互作用研究領域，免疫共沉淀結合質譜技術(Co-IP/MS)是常用的捕獲與誘餌蛋白相互作用分子的技術手段之一，然而其缺點是假陽性多，難于量化，不能滿足大規模蛋白質研究的需要。串聯親和純化結合質譜技術(TAP/MS)很好的解決了上述缺點，該技術通過在誘餌蛋白的一端嵌入一種特殊設計的蛋白標簽，經過多步親和純化后得到更加接近自然狀態下的特定復合物，能夠在真實的生理條件下研究蛋白質的相互作用，在一定程度上打破了蛋白質組學研究的瓶頸。在實際的科學研究中，為了挖掘更加豐富的信息和數據，在使用串聯親和純化結合質譜技術時，往往需要10⁹個數量級或更多的細胞。因而一種帶TAP純化標簽的穩定過表達質粒載體在蛋白相互作用研究領域是一個強有力的研究工具。

發明內容

為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的首要目的在于提供一種用于高效純化相互作用蛋白的克隆載體。該克隆載體基于轉座子原理可快速建立過表達穩定系。

本發明的另一目的在于提供上述克隆載體在蛋白相互作用研究領域中的應用。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

本發明提供的一種用于高效純化相互作用蛋白的克隆載體，其克隆方法是基于Gateway技術的，該載體含有attR1和attR2重組位點，attR1重組位點上游有一段SFB純化標簽序列，在attR1和attR2之間含有反向選擇性標記基因(counter-selectable marker gene)，此外還包括篩選基因。

所述的克隆載體是含有IRDR-L-IRDR-R盒的雙鏈環狀質粒，所述IRDR-L-IRDR-R盒包括IRDR-L序列、啟動子、SFB純化標簽序列、attR1序列、反向選擇性標記基因序列、attR2序列、篩選基因序列和IRDR-R序列。

所述的IRDR-L序列為SEQ ID NO：1中自5′端第9102位～9328位堿基的反向互補序列；所述的IRDR-R序列為SEQ ID NO：1中自5′端第5956位～6183位堿基。

所述的啟動子是CAG啟動子，其序列為SEQ ID NO：1中自5′端第1位～1132位堿基。

所述的SFB純化標簽序列為SEQ ID NO：1中自5′端第1172位～1426位堿基。

所述的attR1序列為SEQ ID NO：1中自5′端第1436位～1560位堿基；所述的attR2序列為SEQ ID NO：1中自5′端第3016位～3140位堿基的反向互補序列。

在本發明中，術語“SFB純化標簽序列”是指S-Flag-SBP標簽，其中S能與S protein beads結合、SBP能與Streptavidin conjugated beads結合、Flag能與Flag抗體結合。

所述的反向選擇性標記基因是指自殺基因ccdB，其序列為SEQ ID NO：1中自5′端第2670位～2975位堿基。

所述的篩選基因包括抗性和熒光篩選基因。

所述的抗性篩選基因是指嘌呤霉素(puromycin)抗性基因，其序列為SEQ ID NO.1中自5′端第3689位～4288位堿基。

所述的熒光篩選基因是指綠色熒光蛋白(GFP)基因，其序列為SEQ ID NO.1中自5′端第4929位～5663位堿基。