[發明專利]一種提高超聲破碎大腸桿菌效率的懸浮液及方法

在審

• 申請號: 201710602125.5
• 申請日: 2017-07-21
• 公開（公告）號: CN107177504A
• 公開（公告）日: 2017-09-19
• 發明（設計）人: 寶福凱;麻明彪;柳愛華;陶律延;彭蕓;白若蘭;戴熙廷;簡苗苗;計震華
• 申請（專利權）人: 昆明醫科大學
• 主分類號: C12N1/06
• 分類號: C12N1/06;C12R1/19
• 代理公司: 昆明今威專利商標代理有限公司53115
• 代理人: 賽曉剛

技術領域

本發明屬于大腸桿菌提取技術領域，尤其涉及一種提高超聲破碎大腸桿菌效率的懸浮液及方法。

背景技術

大腸桿菌是基因工程中最常用的一種原核微生物，由于其遺傳背景清楚，易于培養，生長迅速而倍受生物、基因工程專家的青睞，常被作為外源基因表達的宿主，也是目前應用最廣泛，表達最成功的體系。已使用其成功表達重組胰島素、干擾素、白介素以及表皮生長因子等多種極具醫藥價值的活性蛋白質產品。由于很多重組基因表達的蛋白質產物都存在于大腸桿菌細胞內部，所以必須對大腸桿菌細胞進行破壁后使這些重組蛋白釋放出來，再進行后續的分離純化，最后獲取所需的目的蛋白。因此，在整個過程中，如何簡便高效的破碎大腸桿菌細胞成為提取重組蛋白質產物的關鍵性步驟。

大腸桿菌是一種革蘭陰性菌，其細胞壁的內層為肽聚糖層，最外層為脂多糖層，這一結構使大腸桿菌具備較強的抗拉伸和抗剪切能力。目前常用的破碎方法主要有非機械法和機械法兩大類。非機械法包括酶法、化學滲透法、滲透壓法和凍融法。酶法由于溶菌酶和蛋白酶抑制劑價格十分昂貴，同時溶菌酶自身也影響后續重組蛋白質的分離，限制了該法的應用；使用化學滲透法、滲透壓法和凍融法破碎大腸桿菌，操作過程繁瑣、耗時，且破碎效率低，重組蛋白獲得率低下，只適用于分離一些小分子量的產物。因此，較少使用非機械法破碎大腸桿菌。目前，實驗室通常采用機械法超聲波破碎，首先將菌體懸浮于PBS液中，再放置于超聲破碎儀中進行破碎，PBS液在超聲破碎過程中僅起到平衡滲透壓、維持離子強度和pH的作用，對溶解其中的蛋白保護性較弱，而在超聲破碎的過程中會產生大量的熱量，所以使用PBS液懸浮菌體進行超聲破碎易使蛋白活性降低，破壞蛋白結構，造成蛋白量的損失。因此，開發一種能夠提高大腸桿菌破碎的效率，同時減少蛋白損失的懸浮體系，對提取大腸桿菌中的重組蛋白具有重要意義。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明提供一種提高超聲破碎大腸桿菌效率的懸浮液及方法。本發明提供的新懸浮液可有效提高超聲破碎大腸桿菌的效率，顯著提高了大腸桿菌中重組蛋白的獲得率和蛋白純度。

本發明第一方面，提供一種提高超聲破碎大腸桿菌效率的懸浮液，所述懸浮液包括以下濃度的組分：0.8～1.2M的Tris-HCl，3～7M的NaCl，0.3～1M的EDTA(乙二胺四乙酸)，0.05～0.2M的DTT(二硫蘇糖醇)+15～25wt％的蔗糖和0.08～0.15v/v％的TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)，pH為7.1～8.0。

作為優選，所述懸浮液包括以下濃度的成分：1MTris-HCl+5M NaCl+0.5M EDTA+0.1MDTT+20wt％蔗糖+0.1v/v％TritonX-100+dH₂O。

作為優選，所述懸浮液的pH為7.5～7.6。

本發明第二方面，還提供一種提高超聲破碎大腸桿菌效率的方法，所述方法包括以下步驟：

步驟(1)室溫下將大腸桿菌菌液離心，收取大腸桿菌菌體，將菌體與懸浮液混勻，在冰浴中進行超聲破碎；

步驟(2)將破碎后的菌液分裝，離心，合并上清液，使用濾菌器將上清液進行過濾，收集濾液。

進一步地，步驟(1)超聲條件為：功率90W，超聲10～15s，停頓20～25s，超聲總時間為20～30min。

進一步地，所述菌體與懸浮液的質量體積比為1：10～15。