[發(fā)明專利]食源性致病菌可視化檢測探針及可視化檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710600610.9
• 申請日: 2017-07-21
• 公開（公告）號: CN107177697A
• 公開（公告）日: 2017-09-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張恒;張虹;趙現(xiàn)峰;牛娜;劉惠玲;涂曉波;黃欣迪
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳出入境檢驗檢疫局食品檢驗檢疫技術(shù)中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 深圳市翼智博知識產(chǎn)權(quán)事務(wù)所(普通合伙)44320
• 代理人: 肖偉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及食源性致病菌檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種食源性致病菌可視化檢測探針及可視化檢測方法。

背景技術(shù)

食源性致病菌的檢測手段多種多樣，可概括分為以下三大類：

1、傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，通過細(xì)菌的選擇性分離，將平板上肉眼可見的特征性菌落進(jìn)行確認(rèn)，并對該菌落分離物采用三糖鐵瓊脂、賴氨酸脫羧酶試驗、蛋白胨水、尿素瓊脂、氰化鉀等進(jìn)行生化試驗和多價菌體抗原（O）、多價鞭毛抗原（H）等血清學(xué)檢測，以最終做出鑒定。一般全過程需時至少4～7天，才能得出明確的診斷結(jié)果。雖然，此方法耗時繁瑣，但因其成本較低且較為穩(wěn)定，已作為檢驗檢疫行業(yè)的金標(biāo)準(zhǔn)。

2、基于免疫學(xué)的檢測方法，一般作為初篩方法，所檢測出的陽性樣品最終還需經(jīng)過傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法進(jìn)行進(jìn)一步確證，并且受到環(huán)境因素影響較大，批次之間的結(jié)果可能差異較大，其檢測靈敏度也往往較低。膠體金免疫層析技術(shù)在快速檢測上有自身的優(yōu)勢，其方法得到了美國官定分析化學(xué)家協(xié)會（AOAC International）官方認(rèn)可，能夠?qū)悠分械纳抽T氏菌、大腸桿菌O157等進(jìn)行快速的檢測。該法比起傳統(tǒng)的培養(yǎng)法、ELISA等更加地快捷，但其靈敏度不如PCR方法，且基于免疫學(xué)方法的檢測，受環(huán)境、樣品基質(zhì)等影響較大，只能作為一種初篩方法。

3、基于分子生物學(xué)的檢測方法，本方法首先需要對檢測樣品進(jìn)行核酸提取，即便有全自動核酸提取儀的應(yīng)用，在進(jìn)行大量樣品的前處理過程中仍然有些繁瑣，而且這種儀器價格昂貴，操作起來不夠簡單，應(yīng)用起來有諸多不便。PCR技術(shù)在食源性致病菌檢測是比較成功的，已開發(fā)出一系列商品試劑盒，如霍亂弧菌、沙門氏菌、志賀氏菌、蠟樣芽胞桿菌、大腸埃希氏菌等PCR檢測試劑盒，部分已經(jīng)得到AOAC官方認(rèn)可。除常規(guī)PCR技術(shù)外，多重?zé)晒釶CR技術(shù)的應(yīng)用也日漸增加。

目前，檢測食源性致病菌的方法雖有多種，但是在易操作、靈敏度等方面仍然存在一些不足：如需要貴重的儀器、繁瑣的操作步驟、復(fù)雜的樣品前處理、檢測周期比較長、較高的假陽性、實際樣品檢測存在靈敏度不足等。尤其對于基層實驗室，還停留在傳統(tǒng)選擇性培養(yǎng)方法對致病菌進(jìn)行檢測，缺少一種簡便準(zhǔn)確、高靈敏的快速檢測技術(shù)。

因此，毋需繁瑣的樣品前處理，即能實現(xiàn)致病菌的快速、高靈敏、高特異性檢測，且不需要貴重的儀器，能在基層實驗室進(jìn)行推廣應(yīng)用的快速檢測方法成為了本領(lǐng)域研究的重點方向。若要解決上述問題需具備幾個因素：1）樣品的簡化處理，無需進(jìn)行核酸的提取與純化；2）檢測方法的高靈敏與高特異；3）能夠同時檢測多種致病菌；4）無需貴重儀器，能夠在基層實驗室開展相關(guān)工作。

2007年，Mitani 等在《Nature Methods》上報道了一種新型的等溫擴增技術(shù)，即SmartAmp技術(shù)（Smart Amplification Process Technology），它采用5條引物和DNA錯配結(jié)合蛋白（MutS）進(jìn)行目標(biāo)產(chǎn)物的擴增，能保證擴增產(chǎn)物的“絕對特異”，目前該技術(shù)主要用于單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs）分型以及突變的檢測。2013年，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院劉雪林、宋宏彬等人發(fā)表了一篇介紹SmartAmp技術(shù)的綜述，該文指出在食物、環(huán)境中病原體檢測方法，雖然尚未見相關(guān)研究報道，但SmartAmp方法的原理同樣適用。SmartAmp技術(shù)從樣品的粗制備到擴增的結(jié)束，整個檢測過程20～60分鐘，不會出現(xiàn)非特異性，只要有擴增信號就表示目標(biāo)物的存在，而且SmartAmp技術(shù)的擴增能力是普通PCR技術(shù)的100倍^[14,15]。其“絕對”特異性歸功于引物設(shè)計的獨特性（5條引物TP、FP、OP1、OP2、BP），而DNA錯配結(jié)合蛋白（MutS）更是加強了擴增過程的絕對特異，而不會繼續(xù)擴增造成非特異信號的出現(xiàn)。