[發明專利]RSV-PCV疫苗及其制備方法

有效

• 申請號: 201710599996.6
• 申請日: 2017-07-21
• 公開（公告）號: CN107233567B
• 公開（公告）日: 2020-09-08
• 發明（設計）人: 吳克;艾智武;閆利明;陳煜
• 申請（專利權）人: 武漢博沃生物科技有限公司
• 主分類號: A61K39/295
• 分類號: A61K39/295;A61K39/09;A61K39/155;A61K39/385;A61P31/04;A61P31/14;C07K14/135;C07K19/00;C12N15/74;C12N15/70
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 熊嫻;馮子玲

1.一種RSV-PCV疫苗，其特征在于，所述聯合疫苗包括：

a.RSV(呼吸道合胞病毒)免疫中間體，所述RSV免疫中間體的抗原為可引起機體免疫反應的RSV膜表面融合蛋白F，其中表達蛋白抗原的核酸序列重組在核酸載體上，重組蛋白的核酸序列以減毒胞內細菌為細菌載體；表達F蛋白序列的基因序列如序列表SEQ ID NO：1所示，根據表達蛋白的核酸序列設計特異性引物，引物序列如序列表SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：3所示，引物結合后的待擴增序列如序列表SEQ ID NO：4所示，轉染RSV抗原的細菌載體為SL7207/pcDNA3.1-F；

b.PCV(肺炎球菌)免疫中間體，所述PCV免疫中間體為肺炎球菌多糖抗原及蛋白載體，其中蛋白載體為重組蛋白載體，由大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)蛋白及霍亂弧菌腸毒素B亞單位蛋白(CTB)重組獲得，LTB核酸序列與CTB核酸序列通過引物序列橋接，編碼的載體蛋白序列如序列表SEQ ID NO：10所示；編碼的重組載體蛋白的基因序列如序列表SEQID NO：9所示，如序列表SEQ ID NO：9所示的載體蛋白為LTB蛋白的C端連CTB蛋白的N端，LTB基因與CTB基因之間通過引物連接，LTB基因的R端引物序列如序列表SEQ ID NO：12所示，CTB基因的F端引物序列如序列表SEQ ID NO：13所示；LTB基因的F端引物序列如序列表SEQID NO：11所示，CTB基因的R端引物序列如序列表SEQ ID NO：14所示；所述肺炎球菌多糖抗原是分離提純血清型肺炎球菌莢膜上的多糖，所述肺炎球菌的血清型為4、6B、9V、14、18、19F和23F；

上述組分的免疫中間體分別制備，臨用混合。

2.根據權利要求1所述的RSV-PCV疫苗，其特征在于：肺炎球菌莢膜糖的每種血清型與蛋白載體之間的質量比為1.5～4.5:1。

3.根據權利要求1所述的RSV-PCV疫苗，其特征在于：RSV免疫中間體及PCV免疫中間體均為凍干粉劑，臨用混懸。

4.根據權利要求1所述的RSV-PCV疫苗的制備方法，其特征在于，所述RSV免疫中間體的制備方法包括如下步驟：

a.培養RSV病毒，采用病毒RNA/DNA快速純化試劑盒提取RSV菌體RNA，將提取出的菌體RNA進行逆轉錄(RT)，以逆轉錄后的cDNA產物為模板進行F蛋白基因序列擴增；

b.根據RSV病毒蛋白表達序列設計特異性引物，特異性引物序列如序列表SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示，重組抗原蛋白的表達載體為pcDNA3.1-F；

c.將表達載體轉染至減毒沙門氏菌SL7207中，構建抗原SL7207/pcDNA3.1-F。

5.根據權利要求1所述的RSV-PCV疫苗的制備方法，其特征在于，PCV免疫中間體的制備方法包括如下步驟：

a.根據LTB和CTB的CDS區核酸序列，PCR擴增后，通過BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，凝膠回收LTB-CTB片段和表達載體pET28a，構建pET28a-LTB-CTB質粒；

b.將所述質粒轉化大腸桿菌DH5α菌株，篩選陽性克隆后進行單克隆擴增，IPTG誘導后鑒定；

c.取制備好的肺炎球菌莢膜多糖及重組載體蛋白，以重組LTB-CTB載體蛋白與多糖以1：2質量比混合反應。