[發明專利]一種定量檢測奶粉中β?乳球蛋白的方法

在審

• 申請號: 201710598812.4
• 申請日: 2017-07-21
• 公開（公告）號: CN107607722A
• 公開（公告）日: 2018-01-19
• 發明（設計）人: 胡琴;時夢嵐;許貫虹;魏芳弟;岑瑤;徐曉曼;程霞;柴煜瑩
• 申請（專利權）人: 南京醫科大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/543;G01N33/533
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司32200
• 代理人: 曹翠珍

本發明公開了一種定量檢測奶粉中β?乳球蛋白的方法，首先，將羧基化的Fe₃O₄磁性納米粒與β?LG的適配體連接形成Fe₃O₄?適配體；其次以檸檬酸為碳源、二乙烯三胺為鈍化劑合成碳點(CDs)，并將其與β?LG適配體的互補鏈通過酰胺鍵連接，形成熒光標記探針CDs?cDNA；然后將Fe₃O₄?適配體與CDs?cDNA雜交形成復合物Fe₃O₄?適配體?cDNA?CDs，加入β?LG之后，β?LG和Fe₃O₄?適配體?cDNA?CDs復合物中的適配體結合，使得部分CDs?cDNA脫離釋放到上清液中，通過檢測上清液的熒光強度來定量檢測β?LG的含量，靈敏度高、選擇性好、檢測簡便。

技術領域

本發明屬納米材料、熒光傳感技術和生物分析檢測領域，具體涉及基于磁性納米粒和碳點的熒光適配體傳感平臺定量測定奶粉中β-乳球蛋白(β-LG)的方法。

背景技術

在當今社會，食物過敏是人們所關注的食品安全問題之一。其中，牛乳蛋白過敏是兒童早期最常見的過敏反應。據統計，在嬰兒出生后的頭幾年里，牛奶蛋白過敏率會達到2-3％。β-乳球蛋白(β-LG)被認為是牛奶中主要的致敏蛋白，即使在低濃度的情況下，也能引起過敏反應，癥狀有：胃腸道病變、特應性皮炎、蕁麻疹、過敏性鼻炎、哮喘、血管性水腫、慢性咳嗽等。為了減少牛奶過敏的發生率，相關人員研發了低敏配方奶粉(HF)，且已有市售，以作為牛奶的替代品。這些低敏配方奶粉通常將牛乳清蛋白或酪蛋白經酶或酸處理，以消除它們的致敏性。但仍然會存在極少量的β-LG，在某些情況下，用這些配方喂養的嬰兒仍會發生過敏反應。因此，建立一種能夠檢測低敏配方奶粉中存在的β-LG含量的方法，以評估其安全性是非常必要的。

現有的β-LG的檢測方法，包括HPLC、基于表面等離子體共振(SPR)、電化學免疫傳感、熒光免疫傳感等方法，在這些分析方法中，熒光生物傳感器被認為是最具前景的分析工具之一，由于其反應速度快、成本低、使用簡單、靈敏度高，因此被廣泛的應用于各個領域。

近年來，作為一種新型的熒光納米材料，碳點(CDs)由于具有良好的光穩定性、低毒性、良好的生物相容性和良好的水溶性等特性，引起了人們的極大關注。由于其出色的物理和化學特性，CDs已被廣泛用于檢測蛋白質、金屬離子和其他小分子。然而，熒光分析技術的發展由于缺乏選擇性而受到限制，適配體的引入克服了這一缺點。

適配體(Aptamer)是從隨機序列的核酸庫中，通過指數富集系統進化技術(SELEX)篩選得到的DNA或RNA寡核苷酸，可以與目標分子特異性結合。與抗體相比，適配體具有成本低、穩定性高、易合成和易標記等優勢。近年來有許多基于aptamer的分析方法用于各種目標分子的檢測，但據我們所知，目前還沒有基于碳點的熒光適配體傳感平臺用于β-乳球蛋白的檢測。

發明內容

針對現有技術的問題，本發明的目的在于提供一種定量檢測奶粉中β-乳球蛋白(β-LG)的方法，基于磁性納米粒和碳點的熒光適配體傳感平臺，具有靈敏度高、選擇性好、檢測簡便的優點，可以直接應用于奶粉中β-乳球蛋白(β-LG)的檢測。

為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案為：

一種定量檢測奶粉中β-乳球蛋白的方法，步驟如下：

(1)、制備Fe₃O₄磁性納米粒-適配體復合物:合成羧基修飾的Fe₃O₄磁性納米粒，將Fe₃O₄磁性納米粒在EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)、NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)的作用下，與適配體通過酰胺鍵共價結合，形成Fe₃O₄-適配體復合物；