[發明專利]利用rhsA基因缺失菌株通過發酵生產L?氨基酸的方法

在審

• 申請號: 201710598638.3
• 申請日: 2017-07-21
• 公開（公告）號: CN107267542A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發明（設計）人: 孫會剛;李同祥;劉恩岐;高兆建;張傳麗;崔玨
• 申請（專利權）人: 徐州工程學院
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/31;C12N15/60;C12N15/54;C12P13/08;C12R1/19
• 代理公司: 南京瑞弘專利商標事務所(普通合伙)32249
• 代理人: 陳國強

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，特別涉及一種通過發酵生產L-氨基酸的方法。

背景技術

在工業上，目前L-氨基酸的生產方法主要為生物發酵法，即通過具有L-氨基酸生產能力的各種微生物的發酵來生產L-氨基酸，因此具有L-氨基酸生產能力菌株的獲得是L氨基酸生產方法的核心。目前獲得L氨基酸生產菌株的方法主要有兩種，一種是通過對野生型微生物(野生型菌株)進行誘變的方法，使其具有營養缺陷，并使其對某些代謝物產生拮抗作用，從而獲得優良的工業生產菌株。

近年來隨著基因工程技術的發展，重組DNA技術已經開始普遍應用于微生物代謝工程改造方面，使其成為另外一種重要的獲得L-氨基酸生產菌株的方法。比如，通過提高目標產品合成途徑中關鍵酶的表達，來達到提高微生物L-氨基酸生產能力(CN1305002A)；再比如，通過提高目標產品的分泌蛋白的表達，來達到提高微生物L-氨基酸生產能力(CN1260393A)；或者，通過降低某些基因的表達，來達到提高微生物L-氨基酸生產能力(CN1607246A)；在或者，通過敲除某些基因，使其失活，來達到提高微生物L-氨基酸生產能力(CN1466630A)。

rhs基因是一類廣泛存在于大腸桿菌中的基因序列，其包含核心區域包含重復序列和不同的C末端序列。其家族包括rhsA，rhsB，rhsC，rhsD等。有研究表明，rhsA的過表達會造成細胞在穩定期生存能力下降。目前，對于rhsA功能的研究比較少，其對于L-氨基酸合成是否具有影響還沒有相關的報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種利用rhsA基因缺失菌株通過發酵生產L-氨基酸的方法，以提高L-氨基酸產量和轉化率。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：

一種利用rhsA基因缺失菌株通過發酵生產L-氨基酸的方法，其特征在于：通過在培養基中培養屬于腸桿菌科，并具有L-氨基酸生產能力的細菌，該細菌于培養前進行了修飾，使得rhsA基因缺失，并從細菌的培養基或細胞收集L-氨基酸，來生產L-氨基酸。

進一步的，采用rhsA基因缺失的菌株ATCC21151ΔrhsA，通過發酵的方法生產得到L-蘇氨酸。

所述rhsA基因缺失的菌株ATCC21151ΔrhsA通過下述方法構建得到：

首先，制備菌株ATCC21151的感受態細胞；利用質粒pKD46進行轉化，獲得ATCC21151/pKD46菌株；然后，利用基因片段rhsAknock1轉化ATCC21151/pKD46菌株的感受態細胞，獲得的轉化子利用引物rhsA1-F/rhsA1-R進行驗證，驗證正確的菌株命名為ATCC21151ΔrhsA::SacBCm；最后，利用基因片段rhsAknock2轉化ATCC21151ΔrhsA::SacBCm菌株的感受態細胞，獲得的轉化子利用引物rhsA2-F/rhsA2-R進行驗證，驗證正確的菌株命名為ATCC21151ΔrhsA，至此L-蘇氨酸生產所用的rhsA基因缺失的菌株ATCC21151ΔrhsA構建完畢。

進一步的，采用rhsA基因缺失的菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔrhsA，通過發酵的方法生產得到L-賴氨酸。

所述rhsA基因缺失的菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔrhsA通過下述方法構建得到：

首先，制備菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*的感受態細胞；利用質粒pKD46進行轉化，獲得MG1655/pwsk-lysC*-dapA*(pKD46)菌株；然后，利用基因片段rhsAknock2轉化MG1655/pwsk-lysC*-dapA*(pKD46)菌株的感受態細胞，獲得的轉化子利用引物rhsA2-F/rhsA2-R進行驗證，驗證正確的菌株命名為MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔrhsA::SacBCm；最后，利用基因片段rhsAknock2轉化MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔrhsA::SacBCm菌株的感受態細胞，獲得的轉化子利用引物rhsA2-F/rhsA2-R進行驗證，驗證正確的菌株命名為MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔrhsA，至此L-賴氨酸生產所用的rhsA基因缺失的菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔrhsA構建完畢。

所述菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*通過下述方法構建得到：