[發明專利]利用rhsA基因缺失菌株通過發酵生產L?氨基酸的方法

在審

• 申請號: 201710598638.3
• 申請日: 2017-07-21
• 公開（公告）號: CN107267542A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發明（設計）人: 孫會剛;李同祥;劉恩岐;高兆建;張傳麗;崔玨
• 申請（專利權）人: 徐州工程學院
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/31;C12N15/60;C12N15/54;C12P13/08;C12R1/19
• 代理公司: 南京瑞弘專利商標事務所(普通合伙)32249
• 代理人: 陳國強

1.一種利用rhsA基因缺失菌株通過發酵生產L-氨基酸的方法，其特征在于：通過在培養基中培養屬于腸桿菌科，并具有L-氨基酸生產能力的細菌，該細菌于培養前進行了修飾，使得rhsA基因缺失，并從細菌的培養基或細胞收集L-氨基酸，來生產L-氨基酸。

2.根據權利要求1所述的利用rhsA基因缺失菌株通過發酵生產L-氨基酸的方法，其特征在于：采用rhsA基因缺失的菌株ATCC21151ΔrhsA，通過發酵的方法生產得到L-蘇氨酸。

3.根據權利要求2所述的利用rhsA基因缺失菌株通過發酵生產L-氨基酸的方法，其特征在于：所述rhsA基因缺失的菌株ATCC21151ΔrhsA通過下述方法構建得到：

首先，制備菌株ATCC21151的感受態細胞；利用質粒pKD46進行轉化，獲得ATCC21151/pKD46菌株；然后，利用基因片段rhsAknock1轉化ATCC21151/pKD46菌株的感受態細胞，獲得的轉化子利用引物rhsA1-F/rhsA1-R進行驗證，驗證正確的菌株命名為ATCC21151ΔrhsA::SacBCm；最后，利用基因片段rhsAknock2轉化ATCC21151ΔrhsA::SacBCm菌株的感受態細胞，獲得的轉化子利用引物rhsA2-F/rhsA2-R進行驗證，驗證正確的菌株命名為ATCC21151ΔrhsA，至此L-蘇氨酸生產所用的rhsA基因缺失的菌株ATCC21151ΔrhsA構建完畢。

4.根據權利要求1所述的利用rhsA基因缺失菌株通過發酵生產L-氨基酸的方法，其特征在于：采用rhsA基因缺失的菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔrhsA，通過發酵的方法生產得到L-賴氨酸。

5.根據權利要求4所述的利用rhsA基因缺失菌株通過發酵生產L-氨基酸的方法，其特征在于：所述rhsA基因缺失的菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔrhsA通過下述方法構建得到：

首先，制備菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*的感受態細胞；利用質粒pKD46進行轉化，獲得MG1655/pwsk-lysC*-dapA*(pKD46)菌株；然后，利用基因片段rhsAknock2轉化MG1655/pwsk-lysC*-dapA*(pKD46)菌株的感受態細胞，獲得的轉化子利用引物rhsA2-F/rhsA2-R進行驗證，驗證正確的菌株命名為MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔrhsA::SacBCm；最后，利用基因片段rhsAknock2轉化MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔrhsA::SacBCm菌株的感受態細胞，獲得的轉化子利用引物rhsA2-F/rhsA2-R進行驗證，驗證正確的菌株命名為MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔrhsA，至此L-賴氨酸生產所用的rhsA基因缺失的菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔrhsA構建完畢。

6.根據權利要求5所述的利用rhsA基因缺失菌株通過發酵生產L-氨基酸的方法，其特征在于：所述菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*通過下述方法構建得到：

利用多片段重組的方法構建以低拷貝質粒pWSK29為出發載體，包含dapA基因表達框和lysC基因表達框的質粒pwsk-lysC-dapA；

以質粒pwsk-lysC-dapA為基礎構建dapA和lysC突變體過表達質粒，得到質粒pwsk-lysC*-dapA*；

將質粒pwsk-lysC*-dapA*電轉化至大腸桿菌MG1655；獲得的菌株命名為MG1655/pwsk-lysC*-dapA*。

7.根據權利要求3或5所述的利用rhsA基因缺失菌株通過發酵生產L-氨基酸的方法，其特征在于：所述基因片段rhsAknock1和rhsAknock2通過以下方法構建得到：

首先，根據NCBI公布的大腸桿菌MG1655的基因組序列設計引物rhsAup1-F/rhsAup1-R和rhsAdown1-F/rhsAdown1-R，以大腸桿菌MG1655基因組為模板PCR擴增得到rhsA基因上下游個600-700bp的同源臂基因片段，PCR擴增參數為98℃2min；98℃20s，63℃20s，72℃40s，循環30次，72℃延伸10min；根據質粒ploi4162基因序列，設計引物SacBCm-F/SacBCm-R，以質粒ploi4162為模板，PCR擴增氯霉素(Cm)和蔗糖致死基因(SacB)基因序列，PCR擴增參數為98℃2min；98℃20s，56℃20s，72℃2.5min，循環30次；根據質粒pUC18基因序列，設計引物pUC1-F/pUC1-R，擴增線性pUC18基因片段，PCR擴增參數為98℃2min；98℃20s，57℃20s，72℃1.5min，循環30次；72℃延伸10min。獲得基因片段通過凝膠電泳回收；

利用MultiS One Step Cloning Kit對上述獲得片段進行連接，構建可用于擴增敲除rhsA基因的基因片段的載體，經華大基因公司測序正確后，質粒命名為rhsA1；根據質粒rhsA1基因序列，設計引物rhsA1-F/rhsA1-R，以質粒rhsA1為模板PCR擴增第一次rhsA基因敲除的基因片段rhsAknock1，PCR擴增參數為98℃2min；98℃20s，60℃20s，72℃2.5min，循環30次；獲得基因片段通過凝膠電泳回收，用于進行rhsA基因第一輪敲除。

然后，根據NCBI公布的大腸桿菌MG1655的基因組序列設計引物rhsAup2-F/rhsAup2-R和rhsAdown2-F/rhsAdown2-R，以大腸桿菌MG1655基因組為模板PCR擴增得到rhsA基因上下游各600-700bp的同源臂基因片段，PCR擴增參數為98℃2min；98℃20s，60℃20s，72℃1min，循環30次，72℃延伸10min；根據質粒pUC18基因序列，設計引物pUC2-F/pUC2-R，擴增線性pUC18基因片段，PCR擴增參數為98℃2min；98℃20s，55℃20s，72℃3min，循環30次；72℃延伸10min；獲得基因片段通過凝膠電泳回收；

利用MultiS One Step Cloning Kit對上述獲得片段進行連接，構建可用于擴增敲除rhsA基因的基因片段的載體，經華大基因公司測序正確后，質粒命名為rhsA2；根據質粒rhsA2基因序列，設計引物rhsA2-F/rhsA2-R，以質粒rhsA2為模板PCR擴增第二次rhsA基因敲除的基因片段rhsAknock2，PCR擴增參數為98℃2min；98℃20s，57℃20s，72℃2.5min，循環30次；獲得基因片段通過凝膠電泳回收，用于進行rhsA基因第二輪敲除。