[發明專利]一種懸鉤子屬植物總RNA的快速提取方法

在審

• 申請號: 201710596513.7
• 申請日: 2017-07-20
• 公開（公告）號: CN109280661A
• 公開（公告）日: 2019-01-29
• 發明（設計）人: 周琪
• 申請（專利權）人: 周琪
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種懸鉤子屬植物總RNA的快速提取方法，取少量懸鉤子屬植物材料，液氮冷凍下研磨成粉，經過可選的去糖、離心步驟，或直接加入堿性細胞裂解液，進行溫浴裂解；完成后通過酚?弱酸?氯仿抽提，離心去除蛋白以及絕大部分基因組DNA；上清液中加入醇進行沉淀；離心收集RNA沉淀，經過乙醇洗滌、風干后用DEPC滅菌水溶解，?80℃保存。與已有CTAB法相比，本發明可以快速提取懸鉤子屬植物各器官組織總RNA，用時短，在3小時之內可以輕松完成，而已有方法需要12小時以上。為達到去除蛋白質、多糖以及基因組DNA的目的，傳統方法需經過2～3輪抽提及2輪以上沉淀，操作步驟繁瑣，本方法只進行1輪抽提及1輪沉淀，簡化了操作流程。

技術領域

本發明涉及植物分子生物學領域，具體涉及一種懸鉤子屬植物總RNA的快速提取方法。

背景技術

獲得高質量總RNA是進行分子生物學研究如基因表達水平研究、基因操作如RNA干擾、轉基因等下游研究的前提條件。懸鉤子屬植物的樹莓、黑刺莓中富含有花青素苷、原花青素等多酚類次生代謝產物，這些物質給總RNA提取帶來了重重困難：酚類化合物極易被氧化成 褐色物質，然后與RNA不可逆地結合，導致RNA活性喪失，或形成不溶復合物導致在用氯仿抽提時RNA的大量丟失。

Trizol試劑盒在應對該類植物總RNA提取時顯得無能為力，而傳統的總RNA提取方法如CTAB、SDS等需要較多的植物材料，且需要使用多步抽提來去除多糖、蛋白和基因組DNA。目前使用最多的方法是在植物細胞破碎后，使用LiCl進行RNA的選擇性沉淀，達到去除基因組DNA或多糖的目的。但該方法最大的缺點是耗時太長，一般都選擇沉淀過夜。若改成醇沉淀，DNA污染特別嚴重，需要進一步使用DNase處理，然后經過酚 -氯仿抽提以滅活DNase，結果造成RNA的大量損失。另外，LiCl沉淀后的洗脫過程要求嚴 格，因為殘留的Li+，Cl-會對后續的逆轉錄及PCR擴增產生負面的影響。

發明內容

本發明的目的是提供一種懸鉤子屬植物總RNA的快速提取方法，以有效克服上述現有技術的不足。

本發明創造了一種懸鉤子屬植物總RNA的快速提取方法，它包括以下操作步驟：

1)取2ml離心管，向離心管中加入700～1000μl去糖緩沖液，并加入5～15μlβ-巰基乙醇，于-20℃預冷5～10min；

2)取新鮮植物材料或經液氮速凍后-80℃保存的植物材料0.1～0.15g，加入0.1g交聯聚乙烯基吡咯烷酮，在液氮冷凍條件下研磨成粉狀，迅速轉移至步驟1)的離心管中，溫柔上下顛倒混勻后于冰上靜置10min；

3)在4℃下按照3200×g離心5～10min；

4)徹底去除步驟3)離心所得上清液，向沉淀中加入700～1000μl65℃預熱的細胞裂解液，渦旋1min，于55～65℃保溫20～30min；

5)待步驟4)中的混合液冷卻至室溫后，按順序加入細胞裂解液等體積的水飽和酚，1/80-1/50裂解液體積的pH調節劑，1/5裂解緩沖液體積的氯仿，劇烈震蕩2min；

6)在4℃下按照16000×g離心5～10min；

7)將步驟6)離心所得上清液轉入另一離心管，向管中加入上適量核酸沉淀劑，于-20℃靜置30min以上，在4℃下按照16000×g離心10min后棄上清液，保留沉淀；

8)將步驟7)離心所得沉淀用體積分數為70～75％乙醇洗滌后室溫風干，用DEPC處理水溶解后-80℃保存。

所述去糖緩沖液為：0.05M氯化 鈉、50mM pH 8.0的乙二胺四乙酸二鈉、200mM pH8.0的三羥甲基氨基甲烷；