[發明專利]一種免洗滌圖像類流式熒光檢測方法和系統

有效

• 申請號: 201710595562.9
• 申請日: 2017-07-20
• 公開（公告）號: CN107367456B
• 公開（公告）日: 2020-04-03
• 發明（設計）人: 顏海波;羅浦文
• 申請（專利權）人: 上海睿鈺生物科技有限公司
• 主分類號: G01N15/14
• 分類號: G01N15/14;G01N21/64
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 王寶筠

本申請提供一種免洗滌圖像類流式細胞熒光檢測方法和系統，方法包括，采用預設的目標熒光染料和染色方法對目標樣品進行染色，確保染色孵育后形成一定的游離熒光染料，以使得目標樣品中的所有細胞，能在免洗滌圖像類流式熒光檢測系統下采集到用于密度函數聚類分辨分析的熒光強度值；基于顯微成像系統獲取染色后的目標樣品的顯微熒光圖像；采用計算機圖像識別技術提取目標樣品的灰度值和像素值；基于目標樣品的灰度值和像素值計算目標樣品的熒光強度值，并輸出目標樣品的顯微熒光圖像和密度函數聚類分析的結果。解決了圖像類流式細胞熒光檢測系統下，普通染色洗滌后檢測會出現的，未染色或染色微小的陰性細胞熒光強度值為零，或出現明顯斷崖的問題。

技術領域

本發明涉及細胞檢測技術領域，具體涉及一種免洗滌圖像類流式熒光檢測方法和系統。

背景技術

流式分析技術是一種重要的細胞分析技術，其核心的原理就是，通過熒光染料對細胞或檢測單元進行熒光染色，被熒光染色后的細胞被特定波長的光照射后(入射光)，會發出另一種特定波長的光(發射光)，用光電倍增管(pmt)采集發射光對應的電壓脈沖信號，以該電壓脈沖信號來表達該細胞特定波長的熒光強度。然后，大量采集多個細胞的大小和熒光強度值，采用密度函數，利用陰性細胞和陽性細胞的熒光強度值的差異，進行聚類分析，通過這樣的方法，將具有某種熒光強度屬性的細胞可以被判斷為陰性，另一類熒光強度屬性的細胞被判斷為陽性?；谶@樣的方法，采用不同的熒光染料，可以開展不同種類、不同熒光通道和不同方向的流式細胞熒光分析實驗。

現在，融合了顯微熒光成像技術、圖像識別技術和密度函數聚類分析方法的圖像類流式分析方法成為了一種新的熒光細胞分析方法。這種方法是基于顯微成像系統(電荷耦合元件)獲取的顯微熒光圖像，通過計算機圖像識別技術提取目標樣品的灰度值和像素值來表達熒光強度，這與流式采用非常靈敏的光電倍增管直接采集電壓脈沖信號有很大的不同。在這種方法下，電荷耦合元件輸出的正常可分析的圖像，會濾除很多干擾信號，這會導致在光電倍增管下可以被檢測到的弱熒光信號，在電荷耦合元件輸出圖像時，可能作為干擾信號被濾除掉。

基于這樣的技術基礎，在圖像類流式方法下，采用上述傳統流式的熒光染料和染色方法，會出現以下弊端：

大量處于弱熒光或極弱熒光區域的細胞，在圖像上無法呈現出顯微熒光圖像特征，這樣，這部分細胞就的圖像灰度值會集中得0或靠近0值的一個非常集中的狹小區域。這樣在進行密度函數的聚類分析時，會出現明顯的熒光強度斷崖。因為這個斷崖是電荷耦合元件成像靈敏度的下限導致的，不是樣本本身的特征，因此，這樣的斷崖是失真的，這樣分析的結果就可能是不準確的。所以，傳統的流式熒光染料和染色方法，只有在樣品所發出的熒光強度大于顯微成像系統的成像光路的靈敏度下限時才能進行準確分析。如果出現低于成像光路靈敏度下限的弱熒光，則無法用于圖像類流式分析得到正確的結果。因此，必要開發一種適合圖像類流式分析的熒光染料和染色方法。

發明內容

有鑒于此，本發明實施例提供一種免洗滌圖像類流式熒光檢測方法和系統，以實現解決現有技術中圖像類流式方法下，如果被測樣品熒光強度值低于成熒光成像系統的靈敏度下限時，則無法用于圖像類流式分析得到正確的結果的問題。

為實現上述目的，本發明實施例提供如下技術方案：

一種免洗滌圖像類流式熒光檢測方法，包括：

采用預設的目標熒光染料和染色方法對目標樣品進行染色，確保染色孵育后形成一定的游離熒光染料，以使得目標樣品中的所有細胞，包括經過洗滌后無法在電荷耦合元件下形成熒光成像的弱熒光陰性細胞，在圖像類流式熒光檢測系統下采集到用于密度函數聚類分辨分析的熒光強度值；

基于顯微成像系統獲取染色后的目標樣品的顯微熒光圖像；

采用計算機圖像識別技術提取目標樣品的灰度值和像素值；