[發明專利]一種基于衍生化測定單胺類神經遞質的檢測方法

有效

• 申請號: 201710594346.2
• 申請日: 2017-07-20
• 公開（公告）號: CN107449841B
• 公開（公告）日: 2020-07-17
• 發明（設計）人: 盧金蓮;胡維民;曹衛群;梁文忠;謝斯談;李陟昱;陶怡;張欣
• 申請（專利權）人: 上海藥明康德新藥開發有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 上海浦一知識產權代理有限公司 31211
• 代理人: 鄭權

本發明公開一種基于衍生化測定單胺類神經遞質的檢測方法，通過將單胺類神經遞質與衍生試劑正丁醛等發生衍生反應，得到的衍生化產物利用超高相液相色譜?質譜聯用系統進行分析檢測；所述單胺類神經遞質包括多巴胺、去甲腎上腺素和5?羥基色胺。本方法的衍生化反應條件簡單、溫和、快速、環境友好，可以進行樣品批量化處理；分析速度快，分析方法定量下線低，具有良好的線性范圍，精密度和準確度，實現了對微量的大鼠腦部微透析液中多巴胺、去甲腎上腺素、5?羥基色胺的同時定量分析。

技術領域

本發明涉及分析化學技術領域，具體涉及一種基于衍生化方法測定多種單胺類神經遞質的檢測方法，尤其是涉及一種利用正丁醛作為衍生試劑，聯合微透析技術和超高效液相色譜-質譜法同時檢測大鼠腦部微透析液中多種神經遞質的分析方法。

背景技術

中樞神經系統(central nervous system,CNS)是神經系統中神經元集中的結構，是控制脊椎動物的意識、心理、思維活動及具體行為的指揮中心。神經元中的重要一類為單胺能神經元，其末梢釋放去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)和5-羥色胺(5-HT)等單胺類神經遞質,作用于下一個效應細胞。單胺類神經遞質與CNS相關的多種疾病高度相關。例如，5-HT和NE含量減少，可導致抑郁癥；DA的減少與帕金森氏病高度相關；DA的異常增多與精神分裂癥高度相關，等等。因此，在腦脊液中測定單胺類神經遞質的濃度是神經科學中極其重要的前沿領域。由于單胺類神經遞質一般含量非常低，取樣量受限制，而且基質復雜，干擾較大，導致定量測定的難度大，因而如何能夠準確測定神經遞質的含量是神經遞質釋放研究的重點和難點之一。

目前測定神經遞質時，通常采用電化學、熒光、色譜-紫外可見光譜法或色譜-質譜聯用檢測。這些方法存在許多缺點，例如：電化學檢測法重現性較差，難以同時測定透析液中多種單胺類神經遞質；熒光檢測需昂貴的試劑預先衍生化，樣品預處理繁瑣，分析時間長；色譜-紫外可見光譜法及色譜-質譜法檢測的靈敏度低，難以準確定量。化學衍生化技術能夠有效的提高色譜-質譜法檢測靈敏度，其好處在于：通過衍生化在化合物上修飾易離子化的基團，從而提高單胺類神經遞質在質譜上的響應；由于單胺類神經遞質的極性偏大，在反向色譜上不易保留，而且易于和雜質共流出，通過衍生化可以改善單胺類神經遞質的疏水性，從而改善其在反相色譜上的保留。在現有的衍生化技術中，對于神經遞質的檢測分析多采用鄰苯二甲醛(OPA)、苯甲酰氯、4’-碳酰氯-羅丹明或氘代乙醛為衍生試劑。但是鄰苯二甲醛衍生物具有不穩定、重復性較差、衍生過程時間長等缺點，一定程度上限制了它的廣泛使用；苯甲酰氯和4’-碳酰氯-羅丹明易水解，且對皮膚、眼睛和呼吸道具有刺激作用；氘代乙醛價格較貴，不易獲得，反應中操作不慎可能會產生劇毒的氰化氫，且可重復性較差。因此，針對現有技術中微透析樣品的樣品量低，大多數神經遞質濃度低等困難以及現有分析技術存在的可重復性差、靈敏度低、基質干擾嚴重、衍生化過程復雜、需要用到昂貴且污染嚴重的衍生化試劑、不夠安全環保等問題，開發一種衍生反應條件溫和、簡單、快速、高效、安全、環保、可重復性好、靈敏度高且能同時檢測多種單胺類神經遞質的分析方法將是一項極具實際意義的研究。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于，提供一種基于衍生化測定單胺類神經遞質的檢測方法，其采用新的衍生化試劑，能同時檢測多種單胺類神經遞質，且操作簡單，快速，重現性好，檢測限低，線性范圍良好，具有較好的準確性和精密度。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是：利用正丁醛和氰基硼氫化鈉對單胺類神經遞質進行衍生化，而后得到的衍生化產物利用超高效液相色譜-串聯質譜法進行分析檢測，具體步驟如下：

a.衍生化方法：取10μL神經遞質標準品溶液、神經遞質質控樣品或者待測樣品于2mL玻璃進樣瓶中，然后依次加入10μL內標混合液，25μL氰基硼氫化鈉乙醇溶液和25μL 2％正丁醛乙醇溶液，搖勻之后分別在60℃水浴中孵育80分鐘，得到單胺類神經遞質衍生化產物溶液。

所述神經遞質為單胺類神經遞質，包括多巴胺(DA)、去甲腎上腺素(NE)、5-羥基色胺(5-HT)。