[發明專利]一種基于衍生化測定單胺類神經遞質的檢測方法

有效

• 申請號: 201710594346.2
• 申請日: 2017-07-20
• 公開（公告）號: CN107449841B
• 公開（公告）日: 2020-07-17
• 發明（設計）人: 盧金蓮;胡維民;曹衛群;梁文忠;謝斯談;李陟昱;陶怡;張欣
• 申請（專利權）人: 上海藥明康德新藥開發有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 上海浦一知識產權代理有限公司 31211
• 代理人: 鄭權

1.一種基于衍生化測定腦部微透析液中單胺類神經遞質的檢測方法，其特征在于，所述單胺類神經遞質與衍生試劑正丁醛發生衍生反應，得到的衍生化產物利用超高相液相色譜-質譜聯用系統進行分析檢測；所述單胺類神經遞質包括多巴胺、去甲腎上腺素和5-羥基色胺；

所述檢測方法包括以下步驟：

a.衍生方法：取神經遞質標準品溶液、神經遞質質控樣品或者待測樣品于進樣瓶中，然后依次加入內標混合液，氰基硼氫化鈉乙醇溶液和正丁醛乙醇溶液，搖勻之后分別在60℃水浴中孵育80分鐘，得到單胺類神經遞質衍生化產物溶液；

b.將上述單胺類神經遞質衍生化產物溶液，利用超高效液相色譜-質譜聯用系統進行定性定量分析檢測；所述的超高效液相色譜-質譜聯用系統進行檢測中，液相色譜分離使用Waters色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18 2.1×50mm，1.7μm，柱溫為45℃，采用梯度洗脫；流動相A為0.025％甲酸和1mmol/L乙酸銨在乙腈:水體積比＝5:95溶液中；流動相B為0.025％甲酸和1mmol/L乙酸銨在乙腈:水體積比＝95:5溶液中；液相洗脫梯度條件為：0min流動相組成為97％A+3％B，0.2min流動相組成為97％A+3％B，1.2min流動相組成為20％A+80％B，1.3min流動相組成為2％A+98％B，1.9min流動相組成為2％A+98％B，1.91min流動相組成為97％A+3％B，2.1min流動相組成為97％A+3％B；質譜條件設定為：電離模式是電噴霧離子化，掃描模式為正離子多反應離子監測。

2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，步驟a中所述神經遞質標準品溶液按以下方法配制得到：

稱適量鹽酸多巴胺、去甲腎上腺素、5-羥基色胺鹽酸鹽，分別用25mM L-抗壞血酸水溶液:甲醇體積比＝80:20溶液溶解成1mg/mL的多巴胺(DA)、去甲腎上腺素(NE)、5-羥基色胺(5-HT)標準品儲備液；

將1mg/mL的DA、NE和5-HT用25mM L-抗壞血酸水溶液:甲醇體積比＝80:20溶液分別稀釋到20μg/mL、2μg/mL和2μg/mL作為標準品儲備液1；

然后繼續用25mM L-抗壞血酸水溶液:甲醇體積比＝80:20溶液稀釋100倍，分別得到200ng/mL、20ng/mL和20ng/mL的標準品儲備液2；

將標準品儲備液2，用人工腦脊液稀釋成DA濃度范圍為25-5000pg/mL，NE濃度范圍為5-1000pg/mL和5-HT濃度范圍為2.5-500pg/mL的校準曲線。

3.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，步驟a中所述神經遞質質控樣品按以下方法配制得到：

稱適量鹽酸多巴胺、去甲腎上腺素、5-羥基色胺鹽酸鹽，分別用25mM L-抗壞血酸水溶液:甲醇體積比＝80:20溶液溶解成1mg/mL的多巴胺(DA)、去甲腎上腺素(NE)、5-羥基色胺(5-HT)標準品儲備液；

將1mg/mL的DA、NE和5-HT用25mM L-抗壞血酸水溶液:甲醇體積比＝80:20溶液分別稀釋到20μg/mL、2μg/mL和2μg/mL作為標準品儲備液1；

然后繼續用25mM L-抗壞血酸水溶液:甲醇體積比＝80:20溶液稀釋100倍，分別得到200ng/mL、20ng/mL和20ng/mL的標準品儲備液2；

將標準品儲備液2，用人工腦脊液稀釋成分別代表DA，NE和5-HT定量下限、低、中、高濃度的質控樣品。

4.根據權利要求2或3所述的檢測方法，其特征在于，DA的校準曲線的濃度設置由低到高分別是：25pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、250pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、2500pg/mL、5000pg/mL；NE的校準曲線的濃度設置由低到高分別是：5pg/mL、10pg/mL、20pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、200pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL；5-HT的校準曲線的濃度設置由低到高分別是：2.5pg/mL、5pg/mL、10pg/mL、25pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、250pg/mL、500pg/mL。