[發(fā)明專利]一種沉淀型堿性磷酸酶熒光探針及其合成方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710592026.3
• 申請(qǐng)日: 2017-07-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107367495B
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-09-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張曉兵;劉紅文;譚蔚泓
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 湖南大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N21/64
• 分類號(hào): G01N21/64
• 代理公司: 長(zhǎng)沙永星專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 43001
• 代理人: 周詠

本發(fā)明公開(kāi)了一種沉淀型堿性磷酸酶熒光探針及其合成方法和應(yīng)用。所述熒光探針的合成方法，包括以下步驟：(1)合成新型的固態(tài)熒光染料(HTPQ)；(2)將染料設(shè)計(jì)成堿性磷酸酶的探針(HTPQA)。所述應(yīng)用包括：所述熒光探針在緩沖溶液中對(duì)堿性磷酸酶的響應(yīng)性能；所述熒光探針對(duì)細(xì)胞內(nèi)源性堿性磷酸酶原位檢測(cè)及熒光信號(hào)穩(wěn)定不擴(kuò)散的能力。本發(fā)明首次合成了所述沉淀型固態(tài)熒光染料，解決了傳統(tǒng)熒光探針不能原位檢測(cè)及信號(hào)易擴(kuò)散的問(wèn)題；且所述熒光探針具有固態(tài)熒光性質(zhì)，能夠有效降低背景熒光信號(hào)，提高探針的靈敏度；所述熒光探針對(duì)活細(xì)胞染色效果很好，染色時(shí)間較短，染色效率高，可對(duì)細(xì)胞內(nèi)源性堿性磷酸酶進(jìn)行原位檢測(cè)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于熒光探針技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種沉淀型堿性磷酸酶熒光探針及其合成方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

小分子熒光探針能夠有效監(jiān)測(cè)和成像細(xì)胞生命活動(dòng)的相關(guān)事件，在過(guò)去幾十年中，小分子熒光探針已經(jīng)廣泛用于生物目標(biāo)物的檢測(cè)。然而，已有的熒光探針大多是基于細(xì)胞質(zhì)-可溶性染料設(shè)計(jì)的，如香豆素、羅丹明及熒光素等。這些熒光探針，如果不是定位于特定的細(xì)胞器，一般不能提供生物事件的原位信息，因?yàn)闊晒庑盘?hào)分子會(huì)快速擴(kuò)散遠(yuǎn)離目標(biāo)物反應(yīng)位點(diǎn)。熒光信號(hào)分子會(huì)進(jìn)而擴(kuò)散出細(xì)胞，降低了熒光信號(hào)，導(dǎo)致低的信噪比和低的靈敏度。

目前商品化的“自定位”型蛋白酶熒光探針，即97磷酸酶底物(97phosphatase substrate from ThermoFisher)，該探針與磷酸酶反應(yīng)后，能夠在反應(yīng)位點(diǎn)產(chǎn)生具有綠色熒光的沉淀。然而，該探針的最大激發(fā)在350nm，位于紫外光區(qū)，這非常的不利于生物成像，且熒光共聚焦成像及流式細(xì)胞術(shù)等的最短激發(fā)波長(zhǎng)一般是405nm(比它們的最大激發(fā)大50nm)，這會(huì)導(dǎo)致探針的熒光信號(hào)大大減弱。

堿性磷酸酶(ALP)是催化蛋白質(zhì)與非蛋白質(zhì)底物水解和轉(zhuǎn)磷酸作用的水解酶，包括了一系列廣泛分布在哺乳動(dòng)物組織中的同工酶。ALP在很多組織中都有表達(dá)，如肝臟、骨組織和腎臟，其活性常作為醫(yī)療診斷中的重要生物標(biāo)志物。很多疾病中，ALP活性都會(huì)升高，如骨組織疾病(變形性骨炎、軟骨病、成骨細(xì)胞骨腫瘤)和肝疾病(肝炎、阻塞性黃疸、肝癌)，并且ALP活性檢測(cè)已經(jīng)是臨床上疾病診斷中的常規(guī)手段。因此，針對(duì)目前熒光探針不能夠原位檢測(cè)堿性磷酸酶活性、熒光信號(hào)易擴(kuò)散和熒光成像效果差等難題，研究出一種可原位檢測(cè)活細(xì)胞內(nèi)源性堿性磷酸酶活性、熒光成像對(duì)比度高的熒光探針顯得非常有意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種沉淀型堿性磷酸酶熒光探針及其合成方法和應(yīng)用，以解決原位檢測(cè)活細(xì)胞內(nèi)源性堿性磷酸酶活性、熒光探針在細(xì)胞成像中信號(hào)易擴(kuò)散和熒光成像效果差等技術(shù)問(wèn)題。

本發(fā)明提供這種沉淀型堿性磷酸酶熒光探針，其結(jié)構(gòu)式如下：

本發(fā)明沉淀型堿性磷酸酶熒光探針的合成方法，包括以下步驟：

(1)將化合物1即4-羥基-四苯乙烯和烏洛托品溶于冰醋酸中，加熱回流下3h，二氯甲烷和石油醚為洗脫劑過(guò)柱分離得到淡黃色中間體；

(2)將上述淡黃色中間體、2-氨基-5-氯苯甲酰胺及對(duì)甲苯磺酸在無(wú)水乙醇中回流攪拌5h，冷卻后加入二氯二氰基苯醌，抽濾得到黃色的固體，用乙醇洗滌固體，烘干即得到黃色的新型固態(tài)熒光染料HTPQ即6-氯-2-(2-羥基-5-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯基)-4(3氫)-喹唑啉酮；

(3)在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將HTPQ和吡啶溶于溶劑中，在冰浴中攪拌下反應(yīng)10min，然后緩慢加入三氯氧磷，常溫下攪拌反應(yīng)2h，將反應(yīng)液進(jìn)行萃取收集有機(jī)相，有機(jī)相干燥后減壓旋蒸去掉萃取溶劑，重新溶解粗產(chǎn)物后過(guò)柱分離，二氯甲烷和乙醇的混合溶液為洗脫劑，得到堿性磷酸酶熒光探針HTPQA。

所述步驟(1)中4-羥基-四苯乙烯、烏洛托的物質(zhì)的量之比為1:(1～1.5)。

所述步驟(1)中二氯甲烷和石油醚的體積比為1:(2～10)。