[發(fā)明專利]一種沉淀型堿性磷酸酶熒光探針及其合成方法和應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710592026.3
• 申請日: 2017-07-19
• 公開（公告）號: CN107367495B
• 公開（公告）日: 2019-09-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張曉兵;劉紅文;譚蔚泓
• 申請（專利權(quán)）人: 湖南大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 長沙永星專利商標事務所(普通合伙) 43001
• 代理人: 周詠

1.一種沉淀型堿性磷酸酶熒光探針，其特征在于，所述熒光探針的結(jié)構(gòu)式如下：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的沉淀型堿性磷酸酶熒光探針的合成方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將化合物1即4-羥基-四苯乙烯和烏洛托品溶于冰醋酸中，加熱回流下3h，二氯甲烷和石油醚為洗脫劑過柱分離得到淡黃色中間體；

(2)將上述淡黃色中間體、2-氨基-5-氯苯甲酰胺及對甲苯磺酸在無水乙醇中回流攪拌5h，冷卻后加入二氯二氰基苯醌，抽濾得到黃色的固體，用乙醇洗滌固體，烘干即得到黃色的新型固態(tài)熒光染料HTPQ；

(3)在氮氣保護下，將HTPQ和吡啶溶于溶劑中，在冰浴中攪拌下反應10min，然后緩慢加入三氯氧磷，常溫下攪拌反應2h，將反應液進行萃取收集有機相，有機相干燥后減壓旋蒸去掉萃取溶劑，重新溶解粗產(chǎn)物后過柱分離，二氯甲烷和乙醇的混合溶液為洗脫劑，得到堿性磷酸酶熒光探針HTPQA。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的沉淀型堿性磷酸酶熒光探針的合成方法，其特征在于，所述步驟(1)中4-羥基-四苯乙烯、烏洛托的物質(zhì)的量之比為1:(1～1.5)。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的沉淀型堿性磷酸酶熒光探針的合成方法，其特征在于，所述步驟(1)中二氯甲烷和石油醚的體積比為1:(2～10)。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的沉淀型堿性磷酸酶熒光探針的合成方法，其特征在于，所述步驟(2)中淡黃色中間體、2-氨基-5-氯苯甲酰胺、對甲苯磺酸和二氯二氰基苯醌的物質(zhì)的量之比為1:(1～1.5):(0.1～0.5):(1.5～3)。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的沉淀型堿性磷酸酶熒光探針的合成方法，其特征在于，所述步驟(3)中HTPQ、吡啶和三氯氧磷的物質(zhì)的量之比為1:(1～1.5):(1～1.3)。

7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的沉淀型堿性磷酸酶熒光探針的合成方法，其特征在于，所述步驟(3)中萃取溶劑為二氯甲烷、乙醇和水的混合物，其體積比為2:(1～2):2。

8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的沉淀型堿性磷酸酶熒光探針的合成方法，其特征在于，所述步驟(3)洗脫劑中二氯甲烷和乙醇的體積比為1:(1～50)。

9.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的沉淀型堿性磷酸酶熒光探針在體外緩沖溶液中檢測堿性磷酸酶活性的應用。

10.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的沉淀型堿性磷酸酶熒光探針在活細胞中檢測堿性磷酸酶活性的應用。