[發明專利]一種敲除野生型T細胞TCRalpha鏈的gRNA及方法

在審

• 申請號: 201710591281.6
• 申請日: 2017-07-19
• 公開（公告）號: CN107236741A
• 公開（公告）日: 2017-10-10
• 發明（設計）人: 翁錦生
• 申請（專利權）人: 廣州醫科大學附屬第五醫院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/11;C12N5/10;C12N15/90
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司44202
• 代理人: 郝傳鑫,宋靜娜

技術領域

本發明涉及基因敲除技術領域，尤其是涉及一種敲除野生型T細胞TCR alpha鏈的gRNA及方法。

背景技術

腫瘤是目前人類健康的最大殺手，現有的治療手段包括手術，化療，放療都無法徹底清除腫瘤，免疫T細胞治療為腫瘤患者的康復帶來了巨大希望。目前免疫T細胞治療的方法主要有CAR-T和TCR-T細胞技術，這些T細胞治療的原理是將腫瘤特異性的chimeric antigen receptor(CAR)或者T cell receptor(TCR)基因轉染到正常T細胞上面，使之獲得腫瘤特異性識別的能力，從而殺死腫瘤細胞。然而，由于正常T細胞含有自身的T細胞受體(野生型alpha和beta鏈)，這些野生型的alpha和beta鏈可以影響CAR-T或者TCR-T的表達，導致CAR-T或者TCR-T的活性降低；或者在受者體內攻擊腫瘤外的靶器官和組織，導致供體對受體的移植免疫反應病(GVHD，graft verus host disease)病；或者野生型的TCR alpha和beta鏈和腫瘤特異性的TCR alpha和beta鏈產生錯配，導致T細胞獲得新抗原識別能力，損害受體組織。因此，基因敲除野生型TCR alpha和beta鏈是保證CAR-T或者TCR-T細胞免疫治療安全性的重要措施。通過敲除野生型TCR alpha和beta鏈，我們可以提高CAR-T或者TCR-T的功效，減少GVHD的發生，消除TCR alpha和beta鏈的錯配現象，大大提高免疫T細胞治療腫瘤的效果。

目前基因修飾技術有RNAi干擾技術，ZFN(鋅指核酸酶技術),TALEN(轉錄激活樣酶技術)，已有人用這些技術進行TCR野生型的alpha和beta鏈的敲除工作。敲除后的T細胞不表達野生型的alpha和beta鏈，不引起GVHD病，發生TCR錯配的可能性大大降低。然而，以上技術在實際應用中也存在許多不足，其中，RNAi技術僅僅在RNA水平上面降低野生型alpha和beta鏈的表達，而且是不完全的敲除，殘余的RNA可以繼續表達TCR的蛋白分子；ZFN技術需要制備多個載體，在體外轉錄成RNA后轉入T細胞才可以敲除基因，RNA不穩定，制備繁瑣；Talent技術同樣需要制備多個載體后才可用，而且轉染的效率比較低，影響TCR野生型alpha和beta鏈的敲除效率。

成簇的規律間隔短回文重復序列及其相關的Cas9蛋白系統(CRISPR/Cas9)是一種在細菌和古細菌中廣泛存在，并用于抵御外源病毒感染的天然防御機制。外源的DNA入侵細菌和古細菌后，會被細胞中與外源DNA特定區域互補的RNA引導序列(gRNA)識別，并引導Cas9核酸酶到達識別部位，對目標序列進行酶切，從而降解外源DNA。根據這個特性，CRISPR/Cas9技術廣泛用于基因編輯，其基本步驟是將基因特異性的gRNA和CRISPR/Cas9基因聯合，共同轉入細胞中。在gRNA的引導下，CRISPR/Cas9特異性地敲除某個基因。CRISPR/Cas9基因敲除效率高，制備相對簡易。已經成為基因修飾的主流技術。

針對野生型TCR alpha鏈，我們通過聯合使用gRNA和CRISPR/Cas9的技術，敲除T細胞中的野生型TCR alpha鏈，構建安全可應用的TCR alpha鏈缺失的T細胞，用于CAR-T或者TCR-T的免疫T細胞治療。

發明內容

本發明的第一個目的在于克服現有技術的不足之處而提供一種敲除野生型T細胞TCR alpha鏈的gRNA。

本發明的第二個目的在于提供一種敲除野生型T細胞TCR alpha鏈的方法。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案如下：

一種敲除野生型T細胞TCR alpha鏈的gRNA，所述gRNA的序列如SEQ ID NO：1所示。

一種所述gRNA的編碼DNA，所述gRNA的編碼DNA序列如SEQ ID NO：2所示。

所述核酸序列如下：

SEQ ID NO:1：CACCGGAGAAUCAAAAUCGGUGAAU；

SEQ ID NO:2:CACCGGAGAATCAAAATCGGTGAAT。

本發明提供一種所述gRNA在敲除野生型T細胞TCR alpha鏈中的應用。

一種敲除野生型T細胞TCR alpha鏈的方法，所述方法利用CRISPR/Cas9技術，通過所述gRNA和CRISPR/Cas9共感染T細胞，敲除野生型T細胞TCR alpha鏈，構建野生型TCR alpha鏈缺失的T細胞。