[發明專利]一種敲除野生型T細胞TCRalpha鏈的gRNA及方法

在審

• 申請號: 201710591281.6
• 申請日: 2017-07-19
• 公開（公告）號: CN107236741A
• 公開（公告）日: 2017-10-10
• 發明（設計）人: 翁錦生
• 申請（專利權）人: 廣州醫科大學附屬第五醫院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/11;C12N5/10;C12N15/90
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司44202
• 代理人: 郝傳鑫,宋靜娜

1.一種敲除野生型T細胞TCR alpha鏈的gRNA，其特征在于，所述gRNA的序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一種如權利要求1所述gRNA的編碼DNA，其特征在于，所述gRNA的編碼DNA序列如SEQ ID NO：2所示。

3.如權利要求1所述gRNA在敲除野生型T細胞TCR alpha鏈中的應用。

4.一種敲除野生型T細胞TCR alpha鏈的方法，其特征在于：所述方法利用CRISPR/Cas9技術，通過如權利要求1所述gRNA和CRISPR/Cas9共感染T細胞，敲除野生型T細胞TCR alpha鏈，構建野生型TCR alpha鏈缺失的T細胞。

5.根據權利要求4所述的敲除野生型T細胞TCR alpha鏈的方法，其特征在于，所述gRNA的啟動子為U6啟動子。

6.根據權利要求4所述的敲除野生型T細胞TCR alpha鏈的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)gRNA靶位點的設計，合成編碼gRNA的DNA序列；

2)將步驟1)中合成的DNA片段和酶切過的CPRISPR/cas9表達載體進行連接，構建gRNA/CPRISPR/cas9表達載體；

3)將步驟2)構建的gRNA/CPRISPR/cas9表達載體和第三代慢病毒的包裝載體共感染293T細胞，生成包含gRNA/CPRISPR/cas9基因的慢病毒，用慢病毒轉染正常人T細胞，完成敲除野生型TCR alpha鏈，獲得野生型TCR alpha鏈缺失的正常人T細胞。

7.根據權利要求6所述的敲除野生型T細胞TCR alpha鏈的方法，其特征在于，所述正常人T細胞為正常人周圍血T細胞。

8.根據權利要求6所述的敲除野生型T細胞TCR alpha鏈的方法，其特征在于,所述酶為BbsI酶。

9.根據權利要求6所述的敲除野生型T細胞TCR alpha鏈的方法，其特征在于，所述步驟1)中，合成針對TCR alpha鏈gRNA的DNA編碼序列的方法為：在與gRNA對應的DNA序列的5’末端加上CACC得到正向核苷酸序列，在其互補鏈的5’末端加上AAAC得到反向核苷酸序列，分別合成正向和反向核苷酸序列，然后將合成的序列變性、退火，得到雙鏈DNA片段。