[發(fā)明專利]一種土壤DNA提取方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710590617.7
• 申請(qǐng)日: 2017-07-14
• 公開（公告）號(hào): CN107228787B
• 公開（公告）日: 2019-11-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 伍志偉;劉永琦;金華;薛娜;蘇韞;顏春魯;龔紅霞;張利英;楊玥;李佳蔚;房明
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N1/34
• 分類號(hào): G01N1/34
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明公開了一種土壤DNA提取方法，采用SDS?溶菌酶法裂解土壤樣本，得到裂解液；將所得的裂解液與5×SDS Loading Buffera按比例混勻后加入所得的蛋白膠梳孔內(nèi)，按常規(guī)方法進(jìn)行電泳，待電泳結(jié)束后，輕輕地將蛋白膠梳取出進(jìn)行染色處理，當(dāng)銀白色的目的條帶出現(xiàn)時(shí)，將目的條帶切下，放入盛有2mLPBS的透析袋內(nèi)，放入盛有適量的1×Tris?Gly電泳緩沖液的水平電泳槽內(nèi)，并將水平電泳槽置于冰上進(jìn)行電泳；將所得的透析袋置于盛有滅菌的PBS的小燒杯內(nèi)，4℃透析過夜，次日，收集透析袋內(nèi)的上清液，即得土壤DNA提取液。本發(fā)明操作步驟簡(jiǎn)單，在操作中損失的DNA比較少，得到的DNA量穩(wěn)定。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及土壤DNA提取領(lǐng)域，具體涉及一種土壤DNA提取方法。

背景技術(shù)

目前用于土壤總DNA提取方法主要有三種，直接法、間接法和試劑盒法。直接法是直接從土壤中裂解細(xì)胞，但目前的傳統(tǒng)方法操作步驟太多，所以導(dǎo)致DNA產(chǎn)量低，且最后得到的DNA量不穩(wěn)定。間接法是先分離細(xì)胞再裂解，但許多微生物與土壤顆粒緊密結(jié)合，細(xì)胞不易分離，導(dǎo)致最終的DNA產(chǎn)量低，且耗時(shí)較長(zhǎng)。試劑盒法具有簡(jiǎn)單、快速的優(yōu)點(diǎn)，但價(jià)格昂貴，對(duì)大批量樣品提取不經(jīng)濟(jì)，而且有時(shí)候DNA提取不出來。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種土壤DNA提取方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

一種土壤DNA提取方法，包括如下步驟：

S1、采用SDS-溶菌酶法裂解土壤樣本，得到裂解液；

S2、量取雙蒸水2.45mL，30％的丙烯酰胺3.0mL，1.5mmol/L的Tris-HCl 1.9mL，10％的十二烷基硫酸鈉75.0μL，10％的APS 75.0μL，TEMED 3.0μL，充分混合，攪拌均勻后立即加入玻璃制膠平板中，再加入蒸餾水，在分離膠液面上覆蓋一層厚1.0cm的水層，室溫靜置30-40min，直至分離膠聚合；

S3、量取雙蒸水2.1mL，30％的丙烯酰胺0.5mL，1.0mmol/L的Tris-HCl 0.38mL，10％的SDS 30.0μL，10％的APS 30.0μL，TEMED3.0μL，充分混合后，得5％的濃縮膠；

S4、倒掉步驟S2所得的制膠平板上面的水層，用蒸餾水洗滌，濾紙吸干分離膠頂端的水后，保持液面和玻璃板上沿齊平，加入所得的濃縮膠后立即在玻璃板之間插入間距為0.75mm的梳子，室溫靜置20-30min，待濃縮膠完全聚合后，輕輕拔出梳子，得蛋白膠梳；

S5、將所得的裂解液與5×SDS Loading Buffera按體積比4∶1混勻后加入步驟S4所得的蛋白膠梳孔內(nèi)，按常規(guī)方法進(jìn)行電泳，待電泳結(jié)束后，輕輕地將蛋白膠梳取出，放入潔凈的培養(yǎng)皿內(nèi)，加入適量的0.1mol/L的KCl染色10-20min，當(dāng)銀白色的目的條帶出現(xiàn)時(shí)，用干凈的刀片將目的條帶切下，放入盛有2mLPBS的透析袋內(nèi)，放入盛有適量的1×Tris-Gly電泳緩沖液的水平電泳槽內(nèi)，并將水平電泳槽置于冰上，將電壓調(diào)至180V，電泳40-50min，待目的膠帶由淡藍(lán)色變?yōu)橥该鲿r(shí)，電泳結(jié)束；

S6、將步驟S5所得的透析袋置于盛有滅菌的PBS的小燒杯內(nèi)，4℃透析過夜，次日，收集透析袋內(nèi)的上清液，即得土壤DNA提取液。

其中，所述步驟S5中上樣時(shí)從蛋白膠梳的中間開始加。

其中，所述步驟S1具體包括如下步驟：用DNA提取緩沖液重懸土壤，加入蛋白酶K和溶菌酶，混勻后37℃反應(yīng)20min；加入SDS，65℃水浴30min，25℃下10000×g離心10min，得到的上清液即為裂解液。