[發(fā)明專利]一種土壤DNA提取方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710590617.7
• 申請(qǐng)日: 2017-07-14
• 公開（公告）號(hào): CN107228787B
• 公開（公告）日: 2019-11-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 伍志偉;劉永琦;金華;薛娜;蘇韞;顏春魯;龔紅霞;張利英;楊玥;李佳蔚;房明
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N1/34
• 分類號(hào): G01N1/34
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種土壤DNA提取方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1、采用SDS-溶菌酶法裂解土壤樣本，得到裂解液；具體包括如下步驟：用DNA提取緩沖液重懸土壤，加入蛋白酶K和溶菌酶，混勻后37℃反應(yīng)20min；加入SDS，65℃水浴30min，25℃下10000×g離心10min，得到的上清液即為裂解液；所述DNA提取緩沖液的pH為8.0，由水和溶質(zhì)組成；溶質(zhì)及其在所述DNA提取緩沖液中的濃度如下：100mM Tris-HCl，100mM EDTA·2Na，100mM磷酸鈉，1.5M NaCl；

S2、量取雙蒸水2.45mL，30％的丙烯酰胺3.0mL，1.5mmol/L的Tris-HCl 1.9mL，10％的十二烷基硫酸鈉75.0μL，10％的APS 75.0μL，TEMED 3.0μL，充分混合，攪拌均勻后立即加入玻璃制膠平板中，再加入蒸餾水，在分離膠液面上覆蓋一層厚1.0cm的水層，室溫靜置30-40min，直至分離膠聚合；

S3、量取雙蒸水2.1mL，30％的丙烯酰胺0.5mL，1.0mmol/L的Tris-HCl 0.38mL，10％的SDS 30.0μL，10％的APS 30.0μL，TEMED3.0μL，充分混合后，得5％的濃縮膠；

S4、倒掉步驟S2所得的制膠平板上面的水層，用蒸餾水洗滌，濾紙吸干分離膠頂端的水后，保持液面和玻璃板上沿齊平，加入所得的濃縮膠后立即在玻璃板之間插入間距為0.75mm的梳子，室溫靜置20-30min，待濃縮膠完全聚合后，輕輕拔出梳子，得蛋白膠梳；

S5、將所得的裂解液與5×SDS Loading Buffera按體積比4∶1混勻后加入步驟S4所得的蛋白膠梳孔內(nèi)，按常規(guī)方法進(jìn)行電泳，待電泳結(jié)束后，輕輕地將蛋白膠梳取出，放入潔凈的培養(yǎng)皿內(nèi)，加入適量的0.1mol/L的KCl染色10-20min，當(dāng)銀白色的目的條帶出現(xiàn)時(shí)，用干凈的刀片將目的條帶切下，放入盛有2mLPBS的透析袋內(nèi)，放入盛有適量的1×Tris-Gly電泳緩沖液的水平電泳槽內(nèi)，并將水平電泳槽置于冰上，將電壓調(diào)至180V，電泳40-50min，待目的膠帶由淡藍(lán)色變?yōu)橥该鲿r(shí)，電泳結(jié)束；

S6、將步驟S5所得的透析袋置于盛有滅菌的PBS的小燒杯內(nèi)，4℃透析過夜，次日，收集透析袋內(nèi)的上清液，即得土壤DNA提取液。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種土壤DNA提取方法，其特征在于，所述步驟S5中上樣時(shí)從蛋白膠梳的中間開始加。