[發明專利]一種高產β-1,3-葡聚糖枯草芽孢桿菌及其應用

有效

• 申請號: 201710590529.7
• 申請日: 2017-07-19
• 公開（公告）號: CN107267420B
• 公開（公告）日: 2020-06-19
• 發明（設計）人: 賈源賓;趙伯濤;葛洪;王志來;汪明新;徐軍;謝鑫;錢驊;黃曉德;朱羽堯;陳斌
• 申請（專利權）人: 南京曜動節能環保科技有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P19/08;C12R1/125
• 代理公司: 南京蘇科專利代理有限責任公司 32102
• 代理人: 孫立冰

本發明屬于微生物技術領域，具體涉及一種高產β?1,3?葡聚糖枯草芽孢桿菌菌株及其發酵培養方法。其特征是發明人從土壤中篩選得到菌株ZJS?1，分類命名：枯草芽孢桿菌，Bacillus subtilis。保藏號是：CGMCC No.12176。本發明的菌株ZJS?1通過發酵培養直接轉化蔗糖合成β?1,3?葡聚糖，即直接以蔗糖為碳源，通過生物轉化合成β?1,3?葡聚糖。

技術領域

本發明屬于微生物技術領域，具體涉及一種高產β-1,3-葡聚糖枯草芽孢桿菌菌株及其發酵培養方法。

背景技術

β-1,3葡聚糖是一類主鏈結構由β-1,3-糖苷鍵連接，通常含有不同比例和大小的β-1,3，β-1,4，β-1,6糖苷鍵連接的支鏈的大分子多糖。20世紀60年代，就已證明β-1,3葡聚糖具有增強哺乳動物免疫活力、抗腫瘤、抗細菌、抗病毒、降低膽固醇和血脂、促進傷口愈合等作用，顯示了其在藥學領域的潛在應用價值，受到廣泛的關注；近年來的研究表明，β-1,3葡聚糖應用在日化產品中，可以起到保濕、抗炎、抗衰老、去皺、去頭屑、退黃、加快修復、增加皮膚彈性的作用，應用于畜禽養殖可以增強畜禽的機體免疫力、改善胃腸功能等，進一步拓展了β-1,3葡聚糖應用領域。

傳統上生產β-葡聚糖的方法是從香菇、酵母、燕麥、青稞中提取獲得。由于受到原料生產規模、生產周期的限制，通過提取方式生產β-葡聚糖遠遠不能滿足的市場需求。為了改進β-葡聚糖生產方式，提升β-葡聚糖的產量，近年來，國內外研究中開展了高產β-葡聚糖的微生物的篩選研究，目前已經篩選出的適于規模化生產β-葡聚糖微生物包括啤酒酵母、枯草芽孢桿菌等，國外已經開展了通過微生物發酵培養規模化生產β-葡聚糖細菌來源的β-葡聚糖酶的嘗試，但我國微生物發酵生產β-葡聚糖的相關研究起步較晚，以啤酒酵母為主，其他來源較少。但啤酒酵母生產β-葡聚糖仍存在原料轉化利用率低，產品純度低、品質差等缺點，難以適應當前市場對高品質β-葡聚糖的需求。

發明內容

本發明公開了一種高產β-1,3-葡聚糖枯草芽孢桿菌菌株ZJS-1。本發明的菌株ZJS-1通過發酵培養直接轉化蔗糖合成β-1,3-葡聚糖，即直接以蔗糖為碳源，通過生物轉化合成β-1,3-葡聚糖。

發明人通過菌落拉絲法和液體培養物中葡聚糖產量的方法從南京市鐘山風景區林下土壤中篩選得到，命名為ZJS-1，該菌菌落呈白色，粗糙褶皺，邊緣不整齊。分類命名：枯草芽孢桿菌，Bacillus subtilis。其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號是：CGMCC No.12176。保藏時間：2016年3月4日，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學研究微生物研究所。

高產β-1,3-葡聚糖菌株的篩選：

按照KH₂PO₄ 0.3-1.0g/L；CaCl₂ 0.3-1.0g/L，MgSO4 0.6-1.2g/L，FeSO₄·7H₂O0.6-1.2g/L，蔗糖3.0-8.0g/L，瓊脂12.0-18.0g/L的濃度稱取物質，重蒸水溶解定容，調pH6.5-7.0，115-121℃滅菌20-30分鐘；制成篩選培養基；將采集的用于篩選的土樣0.5-1.5g或水樣1-2mL加入5mL液體培養基中，于30℃搖床中振蕩培養48-72h用于富集產葡聚糖菌，之后將48-72h培養物以5％的接種量涂布于篩選平板培養基中，25-30℃倒置培養48-72h，利用菌落拉絲法檢測各菌落的拉絲性能，選取具有明顯拉絲性能的菌落轉接到5-8mL篩選液體培養基中，28-32℃，150-300rpm震蕩培養24-48h，取樣利用剛果紅法測定各培養物中β-1,3-葡聚糖含量，選取β-1,3-葡聚糖含量最高的菌株，篩選結果見圖1。由圖1可知，1號菌株ZJS-1的β-1,3-葡聚糖產量最高，因此選取菌株ZJS-1為高產β-1,3-葡聚糖的菌株，對其進行遺傳分析和培養條件優化。

產β-1,3-葡聚糖菌株的16S rDNA鑒定：