[發明專利]使血液單個核細胞逆向分化產生人血源性自體視網膜干細胞的方法、試劑盒及用途

有效

• 申請號: 201710589914.X
• 申請日: 2017-07-19
• 公開（公告）號: CN107326009B
• 公開（公告）日: 2019-03-08
• 發明（設計）人: 林雄斌;湯世坤;任海英;廖喚昭;徐勝美;黃衛紅;吳銘
• 申請（專利權）人: 深圳百年干細胞技術研究院有限公司
• 主分類號: C12N5/0797
• 分類號: C12N5/0797;A61L27/38
• 代理公司: 佛山市廣盈專利商標事務所(普通合伙) 44339
• 代理人: 楊樂兵

本發明屬于生物技術領域，具體涉及生物醫學技術領域，更具體涉及一種使人的體細胞逆向分化產生自體視網膜干細胞的細胞培養方法、試劑盒和應用。所述的制備方法通過將自體細胞作為原料細胞依次經細胞培養液A1、細胞培養液A2和細胞培養液A3培養后得到血源性自體視網膜干細胞。本發明應用人自體血液細胞作為原料細胞，使之逆向分化生產人血源性自體視網膜干細胞。本發明應用小分子物質組成的細胞培養液配方，在不改變人的體細胞染色體DNA序列，不插入任何外來基因或DNA片段的情況下，快速使人的自體血液細胞逆向分化產生血源性自體視網膜干細胞。本發明在生產速度、產量、純度方面均明顯優于現有技術。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及生物醫學技術領域，更具體涉及一種使人的體細胞逆向分化產生自體視網膜干細胞的細胞培養方法、試劑盒和應用。

背景技術

視網膜是位于眼底的中樞神經系統特化的一部分,起源于神經外胚層，是一層對光敏感的、精細的膜樣結構，是形成各種視功能的基礎。由胚胎時期神經外胚葉形成的視杯發育而來，視杯外層形成單一的視網膜色素上皮層，視杯內層則分化為視網膜神經感覺層。視網膜神經感覺層由外向內分別是:視錐、視桿層，外界膜，外核層，外叢狀層，內核層，內叢狀層，神經節細胞層，神經纖維層，內界膜(屬Müller細胞的基底膜)。

眼底疾病多數會導致嚴重的致盲眼病，視網膜神經元的不可逆性的丟失是許多眼底疾病的最終結局，主要有各種視網膜疾病和年齡相關性黃斑變性。目前尚無有效的治療方法。如何地治療和預防眼底性疾病，再生和修復視網膜病變和黃斑病變，恢復眼底疾病患者的視功能，是當今神經科學領域面臨的挑戰。近10年來，國內外醫學界利用視網膜干細胞修復各種視網膜變性和損傷，給各種視網膜疾病、黃斑變性等致盲性眼底疾病的治療和預防帶來了曙光。

目前，應用型的視網膜干細胞多來源于：1、胚胎干細胞(ESCs)誘導的異體視網膜干細胞；2、睫狀上皮來源的干細胞或祖細胞，在體外進行培養；3、臍帶血干細胞/間充質干細胞來源的視網膜細胞；4、誘導的多能干細胞(IPS)來源的視網膜干細胞。

中國專利申請201480066229公開了一種提供用于產生分離的哺乳動物原始視網膜干細胞(pRSC)的體外方法，其包括：(a)在不含飼養細胞、飼養層條件化培養基或血清的細胞培養基中培養來自哺乳動物的分離的胚胎干細胞(ESC)以產生并生長所述分離的ESC的培養物；和(b)使這樣生長的所述分離的ESC的所述培養物與Wnt或TGF-β/BMP信號傳導抑制劑中的一種或多種接觸以使(a)的所述分離的ESC分化成原始視網膜干細胞，由此產生分離的哺乳動物pRSC。然而通過ESC誘導制備視網膜干細胞的方法通常耗時較長，誘導產生時間需要8-15周，此外其制備的視網膜干細胞在應用時也會出現異體免疫排斥反應。

睫狀上皮來源的干細胞或祖細胞，在體外進行培養也有可能分化形成視網膜干細胞，然而研究已經證明睫狀體細胞并不是真正意義上的視網膜干細胞，因此不適合應用于視網膜再生的治療。

中國專利申請201510636044公開了一種治療視網膜變性的干細胞制劑及其使用方法。通過將骨髓間充質干細胞優化培養和誘導分化，提高了其分化為視網膜神經前體樣細胞效率，其移植效果與視網膜前體細胞具有相似的功效，使移植區視網膜功能有效改善，為干細胞移植治療視網膜變性疾病提供了一種理想的細胞來源。然而臍帶血干細胞/間充質干細胞來源的視網膜細胞的方法，存在體外培養時間長達數周，穩定性差，污染率高，獲得的視網膜細胞數量少，產量極少，生物特性不穩定等問題。

中國專利申請201210301765公開了一種誘導人多能干細胞分化為視網膜前體細胞的方法。該方法，將人胚胎干細胞或人誘導的多能干細胞在含有N₂的培養基中誘導后，轉入含有神經基礎培養基、敲除的血清替代物和煙酰胺的視網膜誘導培養基，獲得視網膜前體細胞。誘導的多能干細胞(IPS)是一種轉基因式的自體多能干細胞，然而其致癌風險高，生產工藝復雜，時間長，應用安全性引起嚴重關注。