[發明專利]使血液單個核細胞逆向分化產生人血源性自體視網膜干細胞的方法、試劑盒及用途

有效

• 申請號: 201710589914.X
• 申請日: 2017-07-19
• 公開（公告）號: CN107326009B
• 公開（公告）日: 2019-03-08
• 發明（設計）人: 林雄斌;湯世坤;任海英;廖喚昭;徐勝美;黃衛紅;吳銘
• 申請（專利權）人: 深圳百年干細胞技術研究院有限公司
• 主分類號: C12N5/0797
• 分類號: C12N5/0797;A61L27/38
• 代理公司: 佛山市廣盈專利商標事務所(普通合伙) 44339
• 代理人: 楊樂兵

1.使人體的單個核細胞逆向分化產生自體視網膜干細胞的一組培養液，其特征在于：所述的 一組培養液包括細胞培養液A1、細胞培養液A2和細胞培養液A3；

所述的細胞培養液A1、細胞培養液A2和細胞培養液A3在10～100級潔凈度的安全操作臺里操作，4～10℃的低溫條件下配制；

細胞培養液A1的配制：

在500mL DMEM培養液中加入以下成分：

10μM的RHO激酶抑制劑Y-27632、10ng/mL的干細胞因子、10ng/mL的白細胞介素3、10ng/mL的白細胞介素6、 10ng/mL的白細胞介素11、10ng/mL的巨噬細胞集落刺激因子、10ng/mL的粒細胞集落刺激因子、10μg/mL的巖藻多糖、10μg/mL的葡聚糖硫酸酯、10nM的AMD 3100、10μM的 M-阿侖膦酸鈉、10μM的氨羥二磷酸二鈉、10ng/mL的神經 生長因子和10μM的二甲亞砜；充分溶解，然后經0.22微米 孔徑的濾器過濾、消毒，配制成細胞培養液A1；

細胞培養液A2的配制：

在500mL DMEM培養液中加入以下成分：

10ng/mL的Dkk1蛋白、10ng/mL的Noggin蛋白、10ng/ mL的γ-分泌酶抑制劑DAPT、10ng/mL的Sonic hedgehog蛋白、10ng/mL的胰島素樣生長因子、10ng/mL的細胞周期蛋白依賴性激酶抑 制因子7、10ng/mL的SMAD3抑制劑SB431542、10ng/mL的 Lefly蛋白、500nmol/L的視黃酸、100nmol/L的激活素A、10ng/mL的堿性成纖維細胞生長因子、100μM的RHO激酶抑制劑Y-27632、10ng/mL的白細胞介素3、10ng/mL的白細胞介素 6、10ng/mL的神經生長因子和10ng/mL的干細胞因子；充分溶解，然后經0.22微米孔徑的濾器過濾、消毒，配制成細胞培養液A2；

細胞培養液A3的配制：

在500mL DMEM培養液中加入以下成分：

10ng/mL的Dkk1蛋白、10ng/mL的Noggin蛋白、10ng/ mL的γ-分泌酶抑制劑DAPT、10ng/mL的Sonic hedgehog蛋白、10ng/mL的胰島素樣生長因子、10ng/mL的細胞周期蛋白依賴性激酶抑 制因子7、10ng/mL的SMAD3抑制劑SB431542、10ng/mL的 Lefly蛋白、200nmol/L的視黃酸、100nmol/L的激活素A、10ng/mL的堿性成纖維細胞生長因子、10μM的RHO激酶抑制劑Y-27632、10ng/mL的白細胞介素3、10ng/mL的白細胞介素6、10ng/mL的神經生長因子、10ng/mL的干細胞因子、10ng/mL的成纖維細胞生長因子2、10ng/mL的成纖維細胞生長因子8、10ng/mL的表皮生長因子、10ng/mL的GSK-3α/β抑制劑CHIR、10ng/mL的TGFβR-1/ALK5抑制劑RepSox、10ng/mL的FGFR1 特異性拮抗劑SU5402、10ng/mL的腦源性神經營養因子； 10ng/mL的神經營養因子-3、10ng/mL的血管內皮生長因子和 10ng/mL的生長因子；充分溶解，然后經0.22微米孔徑的濾器過濾、消毒，配 制成細胞培養液A3。

2.一種用于制備自體視網膜干細胞的試劑盒，其特征在于：所述的試劑盒包括權利要求1所述的一組培養液。

3.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于：所述的試劑盒還包括人體的單個核細胞。

4.權利要求1所述的一組培養液和權利要求2-3任意一項所述的試劑盒在制備用于治療涉及視網膜再生再造和修復的疾病的藥物中的應用。

5.如權利要求4所述的應用，其特征在于：所述的涉及視網膜再生再造和修復的疾病為視 網膜組織和器官的病理損害、創傷壞死和各種退行性病 變。

6.一種使人體的單個核細胞逆向分化產生自體視網膜干細胞的制備方法，其特征在于：所述 的制備方法包括以下步驟：

(1)將自體來源的人體單個核細胞作為原料細胞以2×10⁶-5×10⁶的密度接種于細胞培養皿中；

(2)在37℃和5％的CO₂的環境中，將原料細胞在細胞培養液A1中培養3天，得到細胞1；所述的細胞培養液A1為含有以下成分的DMEM培養液：

10μM的RHO激酶抑制劑Y-27632、10ng/mL的干細胞因子、10ng/mL的白細胞介素3、10ng/mL的白細胞介素6、 10ng/mL的白細胞介素11、10ng/mL的巨噬細胞集落刺激因子、10ng/mL的粒細胞集落刺激因子、10μg/mL的巖藻多糖、10μg/mL的葡聚糖硫酸酯、10nM的AMD 3100、10μM的 M-阿侖膦酸鈉、10μM的氨羥二磷酸二鈉、10ng/mL的神經 生長因子和10μM的二甲亞砜

(3)在37℃和5％的CO₂的環境中，將步驟(2)得到的細胞1再于細胞培養液A2中培養3～6天，得到細胞2；所述的細胞培養液A2為含有以下成分的DMEM培養液：

10ng/mL的Dkk1蛋白、10ng/mL的Noggin蛋白、10ng/ mL的γ-分泌酶抑制劑DAPT、10ng/mL的Sonic hedgehog蛋白、10ng/mL的胰島素樣生長因子、10ng/mL的細胞周期蛋白依賴性激酶抑 制因子7、10ng/mL的SMAD3抑制劑SB431542、10ng/mL的 Lefly蛋白、500nmol/L的視黃酸、100nmol/L的激活素A、10ng/mL的堿性成纖維細胞生長因子、100μM的RHO激酶抑制劑Y-27632、10ng/mL的白細胞介素3、10ng/mL的白細胞介素 6、10ng/mL的神經生長因子和10ng/mL的干細胞因子；

(4)在37℃和5％的CO₂的環境中，將步驟(3)得到的細胞2再于細胞培養液A3中培養3～6天，得到細胞3，細胞3即為自體視網膜干細胞；所述的細胞培養液A3為含有以下成分的DMEM培養液：

10ng/mL的Dkk1蛋白、10ng/mL的Noggin蛋白、10ng/ mL的γ-分泌酶抑制劑DAPT、10ng/mL的Sonic hedgehog蛋白、10ng/mL的胰島素樣生長因子、10ng/mL的細胞周期蛋白依賴性激酶抑 制因子7、10ng/mL的SMAD3抑制劑SB431542、10ng/mL的 Lefly蛋白、200nmol/L的視黃酸、100nmol/L的激活素A、10ng/mL的堿性成纖維細胞生長因子、10μM的RHO激酶抑制劑Y-27632、10ng/mL的白細胞介素3、10ng/mL的白細胞介素6、10ng/mL的神經生長因子、10ng/mL的干細胞因子、10ng/mL的成纖維細胞生長因子2、10ng/mL的成纖維細胞生長因子8、10ng/mL的表皮生長因子、10ng/mL的GSK-3α/β抑制劑CHIR、10ng/mL的TGFβR-1/ALK5抑制劑RepSox、10ng/mL的FGFR1 特異性拮抗劑SU5402、10ng/mL的腦源性神經營養因子； 10ng/mL的神經營養因子-3、10ng/mL的血管內皮生長因子和 10ng/mL的生長因子。