[發明專利]一種重組畢赤酵母工程菌、全細胞催化劑及萊鮑迪苷A的合成方法

在審

• 申請號: 201710589035.7
• 申請日: 2017-07-19
• 公開（公告）號: CN107267406A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發明（設計）人: 林影;梁書利;毛國紅;陳美琪
• 申請（專利權）人: 廣州康琳奈生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12P19/56;C12R1/84
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司44202
• 代理人: 王會龍

技術領域

本發明涉及生物技術及食品化工領域，尤其涉及蔗糖合成酶基因表達的畢赤酵母工程菌以及重組畢赤酵母在催化合成萊鮑迪苷A中的應用。

背景技術

甜菊糖(Steviol glycoside)是一種具有很多優良特性的高甜度天然甜味劑，在食品、飲料、釀酒、醫藥、日用化工等領域均有著巨大的應用價值。甜菊糖帶有后苦味和甘草異味，混合物組分復雜，難以對其質量規格進行統一，限制其應用。甜菊苷(Stevioside)和萊鮑迪苷A(Rebaudioside A)是甜菊糖中含量最豐富的兩種成分，分別占干葉重的5-10％和2-4％。萊鮑迪苷A(RA)是一種無毒、安全、低熱能、高甜度的天然甜昧劑，其甜度是蔗糖的150-300倍，熱值僅為蔗糖的1/300，而且口味純正，沒有后苦味；因而具有巨大的應用價值。目前制備高純度萊鮑迪苷A產品的方法有：培育高產萊鮑迪苷A的甜葉菊品種、樹脂吸附或重結晶提純萊鮑迪苷A、環糊精轉移酶等酶對甜菊糖進行改性。但都存在工藝繁瑣、成本高、效果不佳等缺點。因此，建立一種高效合成萊胞迪苷A的方法十分必要。

發明內容

有鑒于此，本發明所解決的技術問題在于克服現有技術中不足，提供一種表達蔗糖合成酶Sus1的重組畢赤酵母工程菌及其構建方法。

本發明所解決的技術問題還在于將共表達蔗糖合成酶Sus1的重組畢赤酵母工程菌作為全細胞催化劑用于合成萊鮑迪苷A。

為了解決上述技術問題，本發明提供了一種重組畢赤酵母工程菌，所述重組畢赤酵母工程菌是通過將含有如下外源DNA序列的表達載體轉化到畢赤酵母而獲得：

所述外源DNA為編碼蔗糖合成酶Sus1的DNA序列，所述蔗糖合成酶Sus1的氨基酸序列如Seq No.1所示。所述外源DNA序列如Seq No.2所示。

其中，所述表達載體為將所述外源DNA克隆至巴斯德畢赤酵母表達載體pPICZA，得到的胞內表達載體pPICZA-Sus1。

優選地，所述重組畢赤酵母工程菌是所述胞內表達載體pPICZA-Sus1線性化后轉化到巴斯德畢赤酵母而得。

另外，本發明還提供了一種全細胞催化劑，包含本發明的重組畢赤酵母工程菌。

優選地，所述全細胞催化劑是通過如下步驟制備而成：

所述全細胞催化劑是通過如下步驟制備而成：

挑取重組畢赤酵母工程菌接種到BMGY培養基，30℃，250rpm培養至OD600接近6.0，于6000rpm,4℃離心5min收集細胞，然后將收集的細胞重懸到BMMY培養基至起始OD600接近1.0，于30℃，250rpm震蕩培養，每天補加終濃度1％甲醇；發酵3天后在6000rpm，4℃離心5min回收菌體；凍干后即為重組畢赤酵母全細胞催化劑。

另外，本發明還提供了一種萊鮑迪苷A的合成方法，該方法以蔗糖、二磷酸尿苷、甜菊苷為原料，以上述方案中的全細胞催化劑為催化劑合成萊鮑迪苷A。

優選地，該方法包括如下步驟：

包括如下步驟：

(1)按如下組分及其濃度制備反應體系；

50mM PBS緩沖液，

3mM MgCl₂，

50mM蔗糖，

1mM UDP，

10mg/mL甜菊苷；

(2)加入菌體量為30OD重組畢赤酵母與30OD菌體量的全細胞催化劑，于37℃進行反應，反應12h后停止反應；

(3)將反應液稀釋5倍后，用0.2um水系尼龍膜過濾后用液相色譜檢測RA的合成。

與現有技術相比，本發明優點在于：

與現有技術相比，本發明優點在于：構建得到的重組畢赤酵母工程菌能實現Sus1的胞內表達；發酵獲得的全細胞催化劑可與表面展示UGT76G1菌株聯合催化合成RA，RA產量達到2.2mg/mL。不僅提高了萊鮑迪苷A(RA)的合成效率和原料使用率、節約生產成本，并為萊鮑迪苷A(RA)的生產加工開辟新的工業化途徑。

下面結合附圖和具體實施方式進一步詳細描述本發明，但本發明不局限于這些實施方式，任何在本發明基本精神上的改進或替代，仍屬于本發明權利要求書中所要求保護的范圍。

附圖說明

圖1為重組畢赤酵母全細胞催化劑合成RA。A、B分別為反應前后的液相色譜檢測結果。ST和RA的出峰時間分別為10.1min和10.8min左右。

具體實施方式

下面結合具體制備實施例和應用實施例，對本發明作進一步詳細描述，但本發明的實施方式不限于此。