[發(fā)明專利]基于SPR的角蛋白18?3A9的檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710588379.6
• 申請(qǐng)日: 2017-07-18
• 公開（公告）號(hào): CN107202775A
• 公開（公告）日: 2017-09-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李勝;葉小磊;陳平;賀林;陳培華;秦勝營(yíng);蔣太交;宓現(xiàn)強(qiáng);王紅艷;李興旺;張巖;李揚(yáng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 李勝
• 主分類號(hào): G01N21/552
• 分類號(hào): G01N21/552;G01N33/68
• 代理公司: 長(zhǎng)沙星耀專利事務(wù)所(普通合伙)43205
• 代理人: 許伯嚴(yán)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于角蛋白檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于SPR的角蛋白18-3A9的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

盡管已有化學(xué)法、色譜法、光譜法、免疫法、毛細(xì)管電泳法和離子遷移譜法等方法應(yīng)用到生物樣本檢測(cè)中，但化學(xué)法靈敏度低，色譜法、毛細(xì)管電泳法和離子遷移譜法前處理過程時(shí)間較長(zhǎng)，需要專門技術(shù)人員和大規(guī)模昂貴儀器，光譜法靈敏度低以及對(duì)待測(cè)樣品純度要求較高，免疫法操作時(shí)間過長(zhǎng)。目前應(yīng)用于檢測(cè)中最廣泛的為膠體金試紙，但其以結(jié)腸癌易感人群血液為檢測(cè)對(duì)象，且其靈敏度只有300-1000ng/ml。而本技術(shù)以其高靈敏度，可實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)腸癌易感人群的血液中癌癥標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，從而避免了對(duì)客體隱私的侵犯，并大大提高了工作效率。

表面等離子體共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)技術(shù)是基于物理光學(xué)現(xiàn)象的一種分析技術(shù)。當(dāng)偏振光以共振角入射照在金屬和電介質(zhì)的界面上時(shí)，發(fā)生全反射，入射光的一部分能量與表面等離子體波發(fā)生耦合，引起表面等離子體共振，產(chǎn)生光強(qiáng)急劇減少的反射光。利用光學(xué)SPR技術(shù)測(cè)定時(shí)，一般是將一種功能反應(yīng)物(如配體)固定在傳感芯片表面金屬膜上，當(dāng)加入待測(cè)樣品(受體)并使其與傳感芯片上的功能反應(yīng)物相互作用時(shí)，引起體系的折射率變化，從而引起SPR光學(xué)信號(hào)的改變。由于SPR技術(shù)的高識(shí)別性、高靈敏性、快速、原位(無需標(biāo)記)、便捷、實(shí)時(shí)等優(yōu)點(diǎn)，SPR傳感技術(shù)現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究、藥物篩選、食品分析、環(huán)境監(jiān)測(cè)、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域。目前，國(guó)內(nèi)外未見將角蛋白18-3A9檢測(cè)與SPR技術(shù)結(jié)合在一起的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，而提供一種基于SPR的角蛋白18-3A9的檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法可實(shí)時(shí)、快速、高靈敏度的檢測(cè)角蛋白18-3A9，大大降低結(jié)腸癌易感人群檢測(cè)的漏檢率，可應(yīng)用于結(jié)直腸癌的早期篩查，具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。

本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

基于SPR的角蛋白18-3A9的檢測(cè)方法，包括以下步驟:

步驟一：將SPR芯片放置到SPR儀器中作為傳感芯片，儀器溫度設(shè)定為20～30℃，SPR為表面等離子共振的簡(jiǎn)稱；

步驟二：以10～30μL/min的流速往SPR芯片表面通入200～300μLEDC和NHS的混合液，活化該芯片面的羧基基團(tuán)，該SPR芯片經(jīng)EDC/NHS活化后的羧基基團(tuán)可以偶聯(lián)BSA上的氨基；

步驟三：在步驟二活化表面羧基后的SPR芯片上以10～30μL/min的流速通入0.5～2mg/mLBSA-Methamphetamine溶液，使其偶聯(lián)到活化過的羧基上，要求目標(biāo)響應(yīng)值(RU)達(dá)到2000～3000；

步驟四：在步驟三BSA-Methamphetamine偶聯(lián)后的SPR芯片上以10～30μL/min的流速通入75～100μL乙醇胺鹽酸鹽溶液，用以封閉未反應(yīng)的活化過的羧基位點(diǎn)；

步驟五：在步驟四處理后的SPR芯片上以10～30μL/min的流速通入30～50μL梯度濃度的角蛋白18-3A9抗體，確定合適的抗體濃度；

步驟六：將一系列不同濃度的30～50μL的角蛋白18-3A9標(biāo)準(zhǔn)品分別與步驟五確定的濃度抗體混合后，以10～30μL/min的流速依次通入SPR芯片，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；其中角蛋白18-3A9抗原與步驟五確定的濃度抗體等體積；

步驟七：將30～50μL的待檢測(cè)樣品與步驟五確定的濃度抗體等體積混合后，以10～30μL/min的流速通入SPR芯片，記錄響應(yīng)信號(hào)，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得血液中角蛋白18-3A9含量。

更進(jìn)一步地，步驟一中所述SPR芯片是先在玻璃基底上表面鍍一層2～3nm厚的鉻層，再在鉻層上表面鍍一層40～50nm厚的金膜；金膜表面生成巰基烷醇后用環(huán)氧氯丙烷處理生成環(huán)氧基，環(huán)氧基共價(jià)結(jié)合葡聚糖后用溴乙酸處理使葡聚糖羧基化，從而得到羧基化的葡聚糖表面。

更進(jìn)一步地，步驟二中所述EDC和NHS的混合液為EDC和NHS的等體積混合溶液，所述EDC為N-(3-二甲基氨丙基)-N’-乙基碳二亞胺，濃度為0.2～0.4M；NHS為N-羥基琥珀酰亞胺，濃度為0.1～0.2M。

更進(jìn)一步地，步驟三中所述BSA-Methamphetamine為人工合成的角蛋白18-3A9完全抗原，即在BSA(牛血清白蛋白)表面偶聯(lián)了Methamphetamine(角蛋白18-3A9)分子，可購買獲得；pH值為4.5～5.5；

更進(jìn)一步地，步驟四中所述乙醇胺鹽酸鹽溶液的濃度為1～2M。