[發(fā)明專利]基于SPR的角蛋白18?3A9的檢測方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201710588379.6
• 申請日: 2017-07-18
• 公開（公告）號: CN107202775A
• 公開（公告）日: 2017-09-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李勝;葉小磊;陳平;賀林;陳培華;秦勝營;蔣太交;宓現(xiàn)強(qiáng);王紅艷;李興旺;張巖;李揚(yáng)
• 申請（專利權(quán)）人: 李勝
• 主分類號: G01N21/552
• 分類號: G01N21/552;G01N33/68
• 代理公司: 長沙星耀專利事務(wù)所(普通合伙)43205
• 代理人: 許伯嚴(yán)

1.基于SPR的角蛋白18-3A9的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟:

步驟一：將SPR芯片放置到SPR儀器中作為傳感芯片，儀器溫度設(shè)定為20～30℃；

步驟二：以10～30μL/min的流速往SPR芯片表面通入200～300μLEDC和NHS的混合液，活化該芯片面的羧基基團(tuán)；

步驟三：在步驟二活化表面羧基后的SPR芯片上以10～30μL/min的流速通入0.5～2mg/mLBSA-Methamphetamine溶液，使其偶聯(lián)到活化過的羧基上，要求目標(biāo)響應(yīng)值(RU)達(dá)到2000～3000；

步驟四：在步驟三BSA-Methamphetamine偶聯(lián)后的SPR芯片上以10～30μL/min的流速通入75～100μL乙醇胺鹽酸鹽溶液，用以封閉未反應(yīng)的活化過的羧基位點(diǎn)；

步驟五：在步驟四處理后的SPR芯片上以10～30μL/min的流速通入30～50μL梯度濃度的角蛋白18-3A9抗體，確定合適的抗體濃度；

步驟六：將一系列不同濃度的30～50μL的角蛋白18-3A9標(biāo)準(zhǔn)品分別與步驟五確定的濃度抗體混合后，以10～30μL/min的流速依次通入SPR芯片，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；其中角蛋白18-3A9抗原與步驟五確定的濃度抗體等體積；

步驟七：將30～50μL的待檢測樣品與步驟五確定的濃度抗體等體積混合后，以10～30μL/min的流速通入SPR芯片，記錄響應(yīng)信號，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得血液中角蛋白18-3A9含量。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于SPR的角蛋白18-3A9的檢測方法，其特征在于，步驟一中所述SPR芯片是先在玻璃基底上表面鍍一層2～3nm厚的鉻層，再在鉻層上表面鍍一層40～50nm厚的金膜；金膜表面生成巰基烷醇后用環(huán)氧氯丙烷處理生成環(huán)氧基，環(huán)氧基共價結(jié)合葡聚糖后用溴乙酸處理使葡聚糖羧基化，從而得到羧基化的葡聚糖表面。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于SPR的角蛋白18-3A9的檢測方法，其特征在于，步驟二中所述EDC和NHS的混合液為EDC和NHS的等體積混合溶液，所述EDC為N-(3-二甲基氨丙基)-N’-乙基碳二亞胺，濃度為0.2～0.4M；NHS為N-羥基琥珀酰亞胺，濃度為0.1～0.2M。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于SPR的角蛋白18-3A9的檢測方法，其特征在于，步驟三中所述BSA-Methamphetamine為人工合成的角蛋白18-3A9完全抗原。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于SPR的角蛋白18-3A9的檢測方法，其特征在于，步驟四中所述乙醇胺鹽酸鹽溶液的濃度為1～2M。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于SPR的角蛋白18-3A9的檢測方法，其特征在于，步驟五中所述的角蛋白18-3A9抗體為對BSA-Methamphetamine具有特異性識別的鼠源單克隆抗體。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于SPR的角蛋白18-3A9的檢測方法，其特征在于，步驟五中每個角蛋白18-3A9抗體反應(yīng)完成后以10～30μL/min的流速通入NaOH溶液，使抗原抗體解離，完成芯片再生后再加入下一個濃度的抗體；所述的氫氧化鈉溶液為50～100mM。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于SPR的角蛋白18-3A9的檢測方法，其特征在于，在進(jìn)入步驟六前，可進(jìn)行多次注射步驟五確定的最合適濃度抗體,驗證實(shí)驗的重復(fù)性。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于SPR的角蛋白18-3A9的檢測方法，其特征在于，步驟七中的待測樣品為血液或唾液。