[發明專利]一種AsCpf1突變體蛋白、編碼基因、重組表達載體及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201710586386.2
• 申請日: 2017-07-18
• 公開（公告）號: CN107312761B
• 公開（公告）日: 2019-07-05
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 江蘇溥博生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22;C12N15/55;C12N15/70;C07K14/705;G01N33/68
• 代理公司: 徐州市淮海專利事務所 32205
• 代理人: 周敏

1.一種AsCpf1突變體蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一種編碼權利要求1 所述AsCpf1突變體蛋白的基因。

3.根據權利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

4.一種含權利要求2或3所述的基因的重組表達載體。

5.根據權利要求4所述的重組表達載體，其特征在于，所述重組表達載體是以SEQ IDNO：2所示的AsCpf1（S589Q /P711T）為模板設計引物進行PCR擴增，再將純化的PCR產物用無縫克隆方法插入pET15b載體的多克隆位點NcoI和XhoI之間得到。

6.一種權利要求1 所述AsCpf1突變體蛋白的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

①編碼權利要求1 所述AsCpf1突變體蛋白原核表達載體的構建：以合成的核苷酸序列如SEQ ID NO：2 所示的AsCpf1（S589Q /P711T）基因為模板，用PCR的方法擴增編碼AsCpf1突變體蛋白的基因片段，PCR擴增所用正向引物為：5’-GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGTACGGTCGTAAAAAACGTCGTCAGCGTCGTCGTACACAGTTCGAGGGCTTTAC-3’（SEQ ID NO：6），

反向引物為：5’-TCGGGCTTTGTTAGCAGCCGGATCCTCGAGTTAGTGATGATGATGATGATGG-3’（SEQ ID NO：7），

將得到的PCR產物進行純化，用無縫克隆方法插入pET15b載體的多克隆位點NcoI和XhoI之間，得到重組表達載體，經測序驗證閱讀框及DNA序列全部正確，即成功構建了含AsCpf1（S589Q /P711T）基因的原核表達載體，命名為pET15b-AsCpf1（S589Q /P711T）；

②AsCpf1突變體蛋白的表達：將原核表達載體pET15b-AsCpf（S589Q /P711T）轉入表達宿主菌Escherichiacoli BL21（DE3），挑取單克隆接種至新鮮的含50mg/l氨芐青霉素的LB培養基，經37℃搖床培養至OD₆₀₀為0.6，加入終濃度為0.6mM的IPTG誘導AsCpf1（S589Q /P711T）的表達；

③AsCpf1突變體蛋白的純化：收集一升發酵液的細胞，并用40ml冰浴的Buffer A重懸，冰浴超聲裂解細胞，離心取上清，上清通過Ni-IDA柱；上樣完畢用50ml Buffer E洗滌 Ni-IDA 柱；50ml Buffer G洗脫Ni-IDA 柱，分管收集；將洗脫到的目的蛋白過CM離子柱；100mlBuffer D洗滌CM離子柱；10ml Buffer B洗脫CM離子柱，分管收集；使用專業分析軟件Grab-it 2.5 分析TAT-As-cpf1 蛋白純度；洗脫的AsCpf1（S589Q /P711T）合并后將蛋白透析至20mM Tris，50mM NaCl，20% glycerol，pH7.5中；其中，Buffer A的組成為：20mM Tris-HCl，50mM NaCl，1% Triton-100，20% glycerol，pH7.5；Buffer E的組成為：20mM Tris-HCl，2MNaCl，0.1% TritonX-100，20% glycerol，pH7.5；Buffer G的組成為：20mM Tris-HCl，50mMNaCl，0.1% TritonX-100，500mM咪唑，20% glycerol，pH7.5；Buffer D的組成為：20mMTris-HCl，50mM NaCl，0.1% TritonX-100，20% glycerol，pH7.5；Buffer B的組成為：20mMTris-HCl，50mM NaCl，0.1% TritonX-100，20% glycerol，pH7.5。